Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

A terapia celular quimérico de antígeno (CAR)-T revolucionou o campo das terapias celulares adotivas e da imunoterapia contra o câncer. As células CAR-T são células T projetadas expressando um receptor imunológico sintético que combina um fragmento de anticorpo de cadeia única específico de antígeno com domínios de sinalização derivados da cadeia TCRzeta e domínios costimulatórios necessários e suficientes para ativação e co-estimulação de células T^1,2,3,4 . A fabricação de células CAR-T começa extraindo as próprias células T do paciente, seguida pela transdução viral ex vivo do módulo CAR e expansão do produto celular CAR-T com contas magnéticas que funcionam como antígenos artificiais apresentando células⁵. As células CAR-T expandidas são reinfundidas no paciente onde podem engrafar, eliminar células tumorais alvo e até persistir por vários anos após a infusão^6,7,8. Embora a terapia celular CAR-T tenha resultado em taxas notáveis de resposta em malignidades de células B, o sucesso clínico para tumores sólidos tem sido desafiado por múltiplos fatores, incluindo a má infiltração de células T^9,um microambiente tumoral imunossupressor^10,cobertura e especificidade de antígenos, e disfunção celular CAR-T^11,12 . Outra limitação da terapia celular CAR-T atual inclui o uso de células T autólogas. Após várias rodadas de quimioterapia e alta carga tumoral, as células CAR-T podem ser de má qualidade em comparação com produtos CAR-T aogeneicos de doadores saudáveis, além do tempo e despesas associados à fabricação de células CAR-T autólogas. A edição de genes do produto car-t por CRISPR/Cas9 representa uma nova estratégia para superar as limitações atuais das células CAR-T^{13,14,15,16,17}.

CRISPR/Cas9 é um sistema de dois componentes que pode ser usado para edição de genomas direcionados em células de mamíferos^18,19. O Endonuclease Cas9 associado ao CRISPR pode induzir quebras de dois fios específicas do local guiadas por pequenos RNAs através do emparelhamento de base com a sequência de DNA^{alvo 20}. Na ausência de um modelo de reparo, as quebras de dois fios são reparadas pela via de junção final nonhomologous propensa a erros (NHEJ), resultando em mutações de mudança de quadro ou codons de parada prematura através de mutações de inserção e exclusão (INDELs)^19,20,21. Eficiência, facilidade de uso, custo-efetividade e a capacidade de edição de genoma multiplex fazem do CRISPR/Cas9 uma ferramenta poderosa para aumentar a eficácia e a segurança das células CAR-T autólogas e aogenéticas. Essa abordagem também pode ser usada para editar células T direcionadas tcr substituindo a construção do CAR por um TCR. Além disso, células CAR-T aogenéticas que têm potencial limitado para causar enxerto versus doença hospedeira também podem ser geradas pela edição de genes do lócus TCR, b2m e HLA.

Neste protocolo, mostramos como a engenharia CRISPR de células T pode ser combinada com a entrega mediada por vetores virais do CAR-Transgene para gerar produtos celulares CAR-T editados por genoma com maior eficácia e segurança. Um diagrama esquemático de todo o processo é mostrado na Figura 1. Usando essa abordagem, demonstramos um nocaute genético de alta eficiência nas células CAR-T humanas primárias. A Figura 2A descreve em detalhes a linha do tempo de cada etapa para edição e fabricação de células T. Estratégias para o design de RNA guia e validação de nocaute também são discutidas para aplicar essa abordagem a vários genes-alvo.