Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton
Summary
Burada sunulan protokol, sıvı kriyojende vitrifikasyondan önce en az 90 ms karıştırılan kendi kendine fitillenen nanotel ızgaraya iki ilgi örneği sunmak için yeni bir robotik sistem olan Spotiton’un kullanımını açıklamaktadır.
Abstract
İki veya daha fazla etkileşime giren parçacığın erken karşılaşması ile tetiklenen kısa ömürlü moleküler durumların yakalanması, kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) alanı için büyük ilgi çekici deneysel bir zorluk olmaya devam ediyor. Bu “zaman çözümlü” çalışmaları destekleyen birkaç metodolojik strateji geliştirilmiştir, bunlardan biri, Spotiton-a roman robotik sistemi- picoliter boyutlu örnek damlacıkların dağıtımını hassas zamansal ve mekansal kontrol ile birleştirir. Zaman çözümlenen Spotiton iş akışı, erken yapısal yeniden düzenlemelerini minimum örnek hacminden sorgulamak için benzersiz verimli bir yaklaşım sunar. Bağımsız olarak kontrol edilen piezoelektrik dağıtıcılardan ateşlendi, iki örnek indi ve kriyojene doğru dalarken nanotel EM ızgarasına hızla karıştı. Potansiyel olarak yüzlerce ızgara, bir numunenin sadece birkaç mikrolitresinden art arda hızlı bir şekilde hazırlanabilir. Burada, Spotiton sisteminin çalışmasının ayrıntılı bir adım adım protokolü, ızgara hazırlığı sırasında ortaya çıkan belirli sorunları gidermeye odaklanarak sunulmaktadır.
Introduction
Kriyo-EM’nin proteinlerin geçici uygun durumlarını saniye altı zaman ölçeğinde (zaman çözümlenmiş cryo-EM) yakalama ve ortaya çıkarma potansiyeli, Tekniği Kriyochet tarafından kriyo-EM ızgaraları hazırlamak için geliştirilen standart dalma dondurma yöntemi üzerine inşa edilen Berriman ve Unwin1 ile başlayan birkaç grup tarafındangerçekleştirilmiştir 2. Kriyojen kabının hemen üstüne, ince sulu bir tabakaya uygulanmış ve şişmiş ilk numuneyi içeren daralmış bir EM ızgarasına ikinci bir numunenin ince bir buğusunu püskürtmek için sıkıştırılmış azot gazı kullanan bir atomizer eklediler. Bu sistem 1 ms’ye kadar düşük karıştırma süreleri elde edebilse de, yine de ilk örneğin kullanıcı tarafından manuel olarak şişirilmesini talep etti-teknik olarak zorlu bir görev- ve ikinci örneğin nispeten yüksek bir hacmi. Ayrıca, pratikte, iki numunenin karıştırılmasının nerede gerçekleştiğini bilmek zordu, bu da ferritin nanopartiküllerinin karışık numunede fidüsiyal bir belirteç olarak kullanılmasını gerektiriyordu. Howard White ve iş arkadaşlarının sonraki çabaları, şişirme ve püskürtme adımlarının bilgisayar kontrolünü birleştirerek bu püskürtme karıştırma yaklaşımının kontrolünü ve tekrarlanabilirliğini geliştirdi3,4. Numunelerin ne kadar iyi ve nerede karıştığını ele almak için, aynı grup5 ve diğerleri6,7,8,9,10, iki numunenin şırınga pompalarının basıncı altında dar kılcal borularda veya azot gazı tarafından tahrik edilen mikrofabrik, mikroakışkan çiplerde karıştırıldığı bir karıştırma püskürtme yaklaşımı11’e geçmiştir. Bu premiksleme sistemleri sadece tam karıştırma sağlamakla kalmaz, aynı zamanda zaman çözülen çalışmaların çözünürlüğünü artırmak için karıştırma sürelerinin ince ayarlanmasını sağlar.
Spotiton sistemindeki EM ızgaralarına örnek uygulamak için alternatif bir yol olarak piezoelektrik dağıtıcıların tanıtılması, hem numune biriktirmenin hassas bir şekilde hedef alınmasını hem de bir ızgara yapmak için çok daha küçük bir numune hacminin gerekliliğinisağladı 12. Daha sonra, nanotel ızgaralarının ve yolda örnek uygulamanın (“anında” tespit edilmesi) kullanımı, bir şişkinlik adımı ihtiyacını ortadan kaldırdı ve uygulamadan vitrifikasyon sürelerine13,14. Burada açıklanan zaman çözümlü cryo-EM’ye yeni bir yaklaşım için, ilk15’inbirikmesinden hemen sonra hareketli bir nanotel ızgarasına ikinci bir numunenin teslim edilmesini sağlamak için Spotiton sistemine gerekli kontrol donanımı ve yazılım yükseltmeleri ile birlikte ikinci bir dağıtıcı eklendi. Üst üste binen iki örnek, nanoteller tarafından vitrifikasyondan önce ince bir sulu tabakaya kötü oldukları için ızgarada karışır. 90 ms’ye kadar düşük karıştırma süreleri elde edilebilir. Bu protokol, piezoelektrik dağıtım ve nanotel ızgaraları kullanılarak zaman çözümlenmiş deneylerin nasıl gerçekleştirileceği hakkında pratik bilgiler sağlamayı amaçlamaktadır. Ayrıca, donanım ve yazılım kullanım kolaylığı, tutarlılık ve aktarım hızını artırmak için değiştirildiğinden, bu protokol daha önce bildirilen yöntem15’ingüncel bir açıklaması olarak da hizmet eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, Spotiton robotik sisteminin, genellikle bir ilgi proteini ve 90-500 ms karıştırılmış aktif bir ligand olmak üzere iki örnek taşıyan kriyo-EM görüntüleme için ızgara hazırlamak için kullanımını özetlemektedir. İş akışı basit olsa da, kullanıcının üretken bir kılavuz oluşturma oturumu sağlamak için akılda tutması gereken birkaç husus vardır. İlk olarak, piezoelektrik dağıtıcı uçlarından birinin tıkanması veya ateş etmesini engellemesi nadir değildir. Böyle bir arıza, üst veya alt kameradan görüntü çekimlerinde görülen ve her iki ipucu ateşlendikten sonra görülenden gözle görülür şekilde daha dar olan sıvı bir şeritle sonuçlanacaktır. Tıkanıklık, uçta bir hava kabarcığı konaklamasından, damlacık oluşumunu bozardan veya dar uç deliği kurutup kapatan protein örneğinden neden olabilir. Aspire edilmiş örnek işlemde kaybolmasına rağmen, her iki sorun da uçların ultrasonik bir şekilde yıkanması ve numunenin yeniden aspirasyonu ile çözülebilir. Sonraki tıkanıklığı ve numune atıklarını önlemek için, numune aspirasyonundan önce sıvı hatlarını iyice astarlamak (yıkamak) ve oda ve kefen içinde yüksek ve tutarlı bir nem seviyesini korumak çok önemlidir. Ek olarak, özellikle yüksek konsantrasyona sahip bir protein örneği, bakımlı neme rağmen uç ateşlemesini etkileyebilir. İnceleme sekmesindeki ateşleme genliği artırılması, yüksek protein konsantrasyonu nedeniyle zayıf ateşlemeyi kısmen telafi etse de, numunenin en az 1:2 seyreltmesi uç ateşlemesini iyileştirecek ve tıkanmasını önleyecektir.
İkincisi, hedeflenen karıştırma süresi için en uygun kalınlıkte buz üretmek için gereken ideal fitilleme hızına ulaşmak zor olabilir. Genellikle, daha hızlı karıştırma süreleri daha hızlı fitilleme gerektirir, daha yavaş karıştırma süreleri daha yavaş fitilleme gerektirir. İdeal olarak kötü ızgara için, üst kamera görüntüsünde sıvı bir şerit açıkça ayırt edilebilirken, alt kamerada, şeridin konumundaki ızgara çubuklarının sadece çok hafif bir kalınlaşma görünür kalır. Alt kamera görüntüsünde koyu bir şeritle gösterilen yavaş fitilleme, genellikle görüntüleme için çok kalın buz bırakır. Her iki görüntüde de bir şerit olmaması, deliklerde su bırakmamış olabilecek hızlı fitilleme gösterir (Şekil S5). Nanotel yoğunluğu, plazma temizleme ayarları ve süresi ve oda nemine maruz kalma süresi ve ayarlanan oda nemi gibi çeşitli faktörler fitilleme hızını etkileyebilir. Zayıf (yavaş) fitilleme, ızgaradaki nanotellerin seyrek kaplanması sonucu olabilir. Nanotel çözeltisine maruz kalma süresini biraz seyrelterek ve artırarak16, ızgara çubuklarındaki nanotellerin yoğunluğu ve kapsamı artacak ve daha hızlı fitillenmeyi kolaylaştıracaktır. Nanotel yoğunluğu yeterliyse, watt ayarını veya plazma temizleme süresini artırmak da fitillenmeyi artıracaktır. Burada önerilen ayarlar nispeten düşük güç ve uzun süredir, ancak gerekirse değiştirilebilir.
Bununla birlikte, hem belirli bir şebeke grubu hem de plazma temizleme ayarları önceki bir seansta iyi çalıştıysa, nanotellerin oda içindeki yüksek neme aşırı maruz kalmasından ve nemle doygunluğuna ve sıvı tutma kapasitesinin azalmasına yol açan yavaş fitilleme performansı ortaya çıkabilir. Oda neminin ızgara doygunluğu etkisi, cımbız montajı ile ızgaranın dalması arasındaki geçen süreyi en aza indirerek veya dalmadan önce sistem nem seviyesini azaltarak azaltılabilir. Bununla birlikte, ikincisinin protein örneği ile yüklenen ucun tıkanması riskini getirdiği belirtilmelidir. Bu riski dengelemek için, uçları yüksek nem seviyesinin korunduğu kefende tutmak, yeni bir ızgara tutan cımbız takmak için izin gereken süreyi artırabilir. Son olarak, azaltılmış bir dalma süresinin (ızgara ivmesi ve/ veya maksimum hızın artırılmasıyla elde edilir) ızgaranın fitil özelliklerini değiştirmeden daha ince buzla ızgaralara neden olabileceği belirtilmelidir. Bununla birlikte, iki numunenin karıştırma süresi de azaltılacağından, dalma süresi genellikle yavaş fitilleme için değiştirilen bir faktör değildir. Çok hızlı olan, ızgara deliklerinde çok ince veya bulunmayan buzla sonuçlanan fitillemeleri gidermek için, yukarıda özetlenen önlemlerin tersi alınabilir.
Spotiton, altsaniye zaman çözümlü çalışmalar için geliştirilen diğer tekniklerle karşılaştırıldığında belirli avantajlar ve dezavantajlar sunar. Karışık numune şeridi her dağıtıcıdan sadece 2-4 nL sıvı içerdiğinden, numune sınırlı olduğunda birçok ızgara-önemli bir avantaj hazırlamak için her numunenin tek bir 3 μL aliquot’u yeterlidir. Ek olarak, tamamen Spotiton17’yeözgü olmasa da entegre kameralar kullanılarak numune birikiminin gözlemlenmesi, diğer karıştırma cihazlarının bir özelliği değildir ve dalmış ızgaraların ham bir geçiş / başarısızlık değerlendirmesine tabi tutulmasına izin vererek tarama süresini büyük ölçüde azaltır. Sistemin en önemli dezavantajlarından biri, mekanik bileşenlerin fiziksel sınırlamaları ile kısıtlanan ve daha hızlı biyolojik reaksiyonların sorgulanılmasını ulaşılamaz duruma getiren minimum 90 ms karıştırma süresidir. Buna karşılık, mevcut mikroakışkan sistemlerde rutin olarak 10 ms’den daha az bir süre elde edilir. Spotiton tabanlı, ticari olarak kullanılabilen bukalemun sisteminde, tasarım ve inşaat iyileştirmeleri minimum dalma süresini 54 ms’ye düşürdü ve ikinci bir dağıtıcının eklenmesinin Spotiton’un şu anda sunabileceğinden daha hızlı karıştırma sürelerine izin verme olasılığını artırdı.
Bugüne kadar, Spotiton kullanarak erken, kısa ömürlü moleküler durumları araştırmak için 70S ribozom montajı, transmembran iyon kanalında kalsiyum tetiklenen konformasyonel değişiklikler ve GTP hidrolizi15’eyanıt olarak dinamin daralması dahil olmak üzere bir dizi deney yapılmıştır. Bu sonuçların yayınlanmasından bu yana, Spotiton ızgara oluşturma oturumlarının verimini, tekrarlanabilirliğini ve raporlamasını geliştirmek için sisteme çeşitli değişiklikler eklenmiştir. Bunlar arasında çift bölgeli, otomatik nem izleme ve kontrol sistemi, deney görüntüleyici özelliği, yan yana uç inceleme özelliği ve kullanıcı arabirimine birkaç küçük yükseltme bulunur. Yükseltilmiş sistem, daha önce bildirilenlere benzer gelecekteki iki örnek karıştırma deneylerini ve küçük moleküllü terapötik ile protein hedefi ve hatta antikor-antijen kompleksi oluşumu arasındaki gibi hızlı bağlayıcı tahlilleri daha iyi destekleyecektir. İki etkileşim ortağı içeren mevcut ve gelecekteki zaman çözümlenmiş deneyler kesinlikle devam edecek olsa da, üçüncü bir piezoelektrik dağıtıcı ve ilişkili donanımın eklenmesi olası deneylerin yelpazesini daha da genişletebilir. Örneğin, bir deterjanın ilk birikmesi ve ardından ilgi proteini, ardından etkileşime giren veya etkinleştirilen ligand, deterjana uzun süre maruz kalmanın potansiyel olumsuz etkilerini ortadan kaldırabilir, genellikle tercih edilen yönlendirme gibi yaygın yetersiz görüntüleme sonuçlarını önlemek için gereklidir. Spotiton, hem zaten yayınlanmış çalışmalar hem de gelecekteki potansiyel uygulamalar ışığında, kriyo-EM topluluğunun altsaniye zaman çözümlü çalışmaların yürütülmesini kolaylaştırmak için önemli bir aracı temsil ediyor.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Engineering Arts LLC’den (Arizona, ABD) Peter A. Kahn ve Terry Rohde’a Spotiton sisteminin ilk tasarımı ve daha sonra geliştirilmesi için teşekkür ederiz. Yardım ve teknik destek için New York Yapısal Biyoloji Merkezi’ndeki Simons Elektron Mikroskopi Merkezi personeline teşekkür ederiz. Burada sunulan çalışma, NIH (GM103310) ve Simons Vakfı’nın (SF349247) hibeleriyle desteklenen New York Yapısal Biyoloji Merkezi’nde bulunan Otomatik Moleküler Mikroskopi için Ulusal Kaynak’ta gerçekleştirildi.
Materials
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
Referenzen
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -. E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
- Wei, H., et al. Optimizing “self-wicking” nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
