Подготовка криоэлектроновой микроскопической сетки для исследований с временным разрешением с использованием новой роботизированной системы Spotiton
Summary
Протокол, представленный здесь, описывает использование Spotiton, новой роботизированной системы, для доставки двух образцов, представляющих интерес, на самоваривающуюся нанопроволочную сетку, которая смешивается в течение как минимум 90 мс до витрификации в жидком криогене.
Abstract
Захват короткоживущих молекулярных состояний, вызванных ранним столкновением двух или более взаимодействующих частиц, продолжает оставаться экспериментальной задачей, представляющим большой интерес для области криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Было разработано несколько методологических стратегий, которые поддерживают эти исследования с «временным разрешением», одно из которых, Spotiton – новая роботизированная система – сочетает в себе дозирование капель образца размером с пиколитр с точным временным и пространственным контролем. Рабочий процесс Spotiton с временным разрешением предлагает уникально эффективный подход к опросу ранних структурных перестроек с минимальным объемом выборки. Выстреленные из независимо управляемых пьезоэлектрических диспенсеров, два образца приземляются и быстро смешиваются на нанопроволоке ЭМ-сетки, когда она погружается к криогену. Потенциально сотни решеток могут быть получены в быстрой последовательности всего из нескольких микролитров образца. Здесь представлен подробный пошаговый протокол работы системы Spotiton с акцентом на устранение конкретных проблем, возникающих при подготовке сетки.
Introduction
Потенциал крио-ЭМ для захвата и выявления переходных конформационных состояний белков на субсекундной временной шкале (крио-ЭМ с временным разрешением) был реализован несколькими группами, начиная с Берримана и Анвина1, чья техника построена на стандартном методе погружной заморозки, разработанном Дюбоше для подготовки крио-ЭМ-сеток2. Они добавили атомайзер чуть выше чашки криогена, который использовал сжатый газообразный азот для распыления мелкого тумана второго образца на погружающуюся ЭМ-сетку, содержащую первый образец, который был нанесен и смазан тонким водным слоем. Хотя эта система могла достичь времени смешивания всего 1 мс, она по-прежнему требовала ручного промокления первого образца пользователем – технически сложная задача – и относительно большого объема второго образца. Кроме того, на практике было трудно понять, где произошло смешивание двух образцов, что потребовало использования наночастиц ферритина в качестве фидуциального маркера в смешанном образце. Последующие усилия Говарда Уайта и его коллег улучшили контроль и воспроизводимость этого подхода к распылению-смешиванию, включив компьютерное управление этапами3,4пятнистости и распыления. Чтобы решить, насколько хорошо и где смешиваются образцы, та же группа5 и другие6,7,8,9,10 перешли на подход11 смешивания-распыления, при котором два образца смешиваются либо в узких капиллярных трубках под давлением шприцевых насосов, либо в микрофабрикатных микрофлюидных чипах, приводимых в действие газообразным азотом. Эти системы предварительного смешивания не только обеспечивают полное перемешивание, но и позволяют точно настраивать время смешивания для увеличения разрешения исследований с временным разрешением.
Внедрение пьезоэлектрических дозаторов в качестве альтернативного способа нанесения пробы на электромагнитные решетки в системе Spotiton позволило как точно определить осаждение образца, так и требование гораздо меньшего объема образца для создания сетки12. Позже использование нанопроволочных сеток и нанесение образцов в пути («на лету») устранило необходимость в этапе пятнистости и сократило время нанесения на витрификацию13,14. Для нового подхода к крио-ЭМ с временным разрешением, описанного здесь, второй дозатор вместе с необходимыми аппаратными и программными обновлениями управления были добавлены в систему Spotiton, чтобы обеспечить доставку второго образца на движущуюся нанопроволочную сетку почти сразу после осаждения первых15. Два перекрывающихся образца смешиваются на сетке, поскольку они превращаются нанопроволоками в тонкий водный слой перед витрификацией. Может быть достигнуто время перемешивания до 90 мс. Этот протокол предназначен для предоставления практической информации о том, как проводить эксперименты с временным разрешением с использованием пьезоэлектрического дозирования и нанопроволоконых сетей. Кроме того, поскольку аппаратное и программное обеспечение модифицируются для повышения простоты использования, согласованности и пропускной способности, этот протокол также служит в качестве актуального описания ранее сообщенного способа15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает использование роботизированной системы Spotiton для подготовки сеток для крио-ЭМ-визуализации, которые несут два образца, обычно представляющий интерес белок и активирующий лиганд, которые были смешаны в течение 90-500 мс. Хотя рабочий процесс прост, есть несколько соображений, которые пользователь должен иметь в виду, чтобы обеспечить продуктивный сеанс создания сетки. Во-первых, нередко один из наконечников пьезоэлектрического дозатора засоряется или блокируется, предотвращая его срабатывание. Такой сбой приведет к жидкой полосе, видимой на снимках с верхней или нижней камеры, которая заметно уже, чем та, что видна после выстрела обоих наконечников. Закупорка может возникнуть в результате пузырька воздуха, попадающего в наконечник, нарушая образование капель, или из образца белка, который высох и запечатал узкое отверстие кончика. Хотя аспирированный образец теряется в процессе, обе проблемы могут быть решены путем ультразвуковой промывки наконечников и повторной аспирации образца. Чтобы предотвратить последующее засорение и отходы проб, крайне важно тщательно загрунтовать (промыть) линии жидкости перед аспиражаемым образцом и поддерживать высокий и постоянный уровень влажности в камере и кожухе. Кроме того, образец белка с особенно высокой концентрацией может повлиять на обжиг наконечника, несмотря на хорошо поддерживаемую влажность. Хотя увеличение амплитуды обжига на вкладке Inspect может частично компенсировать слабое обжиг из-за высокой концентрации белка, разбавление образца по крайней мере 1: 2 улучшит обжиг наконечника и позволит избежать засорения.
Во-вторых, может быть трудно достичь идеальной скорости впитывания, необходимой для получения льда оптимальной толщины для целевой продолжительности смешивания. Как правило, более быстрое время смешивания потребует более быстрого впитывания, более медленное время смешивания требует более медленного впитывания. Для идеально злой сетки жидкая полоса четко различима на верхнем изображении камеры, в то время как в нижней камере остается видимым только очень небольшое утолщение полос сетки в месте расположения полосы. Медленное впитывание, обозначенное темной полосой на нижнем изображении камеры, обычно оставляет лед, который слишком толстый для изображения. Отсутствие полосы на любом изображении указывает на быстрое впитывание, которое, возможно, не оставило воды в отверстиях(рисунок S5). Несколько факторов, таких как плотность нанопроволоки, настройки и продолжительность плазменной очистки, а также время воздействия и заданный уровень влажности камеры, могут влиять на скорость впитывания. Плохое (медленное) впитывание может быть результатом разреженного покрытия нанопроволок на сетке. За счет незначительного разбавления и увеличения времени воздействия нанопроволокираствора 16,плотность и покрытие нанопроволок на сетчатых стержнях будет увеличиваться, способствуя более быстрому впитываниям. Если плотность нанопроволоки достаточна, увеличение настройки мощности или продолжительности плазменной очистки также улучшит впитывание. Рекомендуемые здесь настройки относительно малой мощности и длительности, но при необходимости могут быть изменены.
Однако, если как конкретная партия сеток, так и настройки плазменной очистки хорошо работали в предыдущем сеансе, медленная производительность впитывания может возникнуть из-за чрезмерного воздействия высокой влажности нанопроволок в камере, что приводит к их насыщению влагой и снижению емкости удержания жидкости. Насыщенный сеткой эффект влажности камеры может быть уменьшен либо путем минимизации времени, прошедшего между установкой пинцеста и погружением сетки, либо за счет снижения уровня влажности системы перед погружением. Следует, однако, отметить, что последнее несет связанный с этим риск того, что наконечник, загруженный образцом белка, засорится. Чтобы компенсировать этот риск, удержание наконечников в савате, где поддерживается высокий уровень влажности, может увеличить допустимое количество времени для монтажа пинцетом, держащим новую сетку. Наконец, следует отметить, что сокращение времени погружения (достигаемое за счет увеличения ускорения сетки и/или максимальной скорости) может привести к сеткам с более тонким льдом без фактического изменения характеристик влаги сетки. Однако, поскольку время смешивания двух образцов также будет сокращено, время погружения не является фактором, который обычно изменяется для решения проблемы медленного впитывания. Чтобы справиться с слишком быстрым витием, приводящим к слишком тонкому льду, либо отсутствующему в отверстиях сетки, могут быть приняты противоположные меры, описанные выше.
Spotiton представляет определенные преимущества и недостатки по сравнению с другими методами, разработанными для субсекундных исследований с временным разрешением. Поскольку смешанная полоса образца содержит только 2-4 нл жидкости из каждого дозатора, одной аликвоты 3 мкл каждого образца достаточно для приготовления многих решеток, что является ключевым преимуществом при ограниченном количестве проб. Кроме того, наблюдение за осаждением проб с помощью встроенных камер, хотя и не является полностью уникальным для Spotiton17,не является особенностью других смесительных устройств и позволяет подвергать погруженные сетки грубой оценке прохода /отказа, что значительно сокращает время скрининга. Одним из ключевых недостатков системы является минимальное время перемешивания 90 мс, ограниченное физическими ограничениями механических компонентов, что делает опрос более быстрых биологических реакций недоступным. Для сравнения, на существующих микрофлюидных системах обычно достигается время менее 10 мс. На коммерчески доступной системе хамелеона на основе Spotiton конструктивные и строительные усовершенствования сократили минимальное время погружения до 54 мс и повысили вероятность того, что добавление второго дозатора может обеспечить более быстрое время смешивания, чем Spotiton может предложить в настоящее время.
На сегодняшний день был проведен ряд экспериментов для изучения ранних, короткоживущих молекулярных состояний с использованием Spotiton, включая сборку рибосомы 70S, вызванные кальцием конформационные изменения в трансмембранном ионном канале и сужение динамина в ответ на гидролиз GTP15. С момента публикации этих результатов в систему было внесено несколько изменений для повышения пропускной способности, воспроизводимости и отчетности о сеансах создания сетки Spotiton. К ним относятся, среди прочего, двухзонная система автоматического мониторинга и контроля влажности, функция просмотра экспериментов, функция параллельного контроля подсказок и несколько незначительных обновлений пользовательского интерфейса. Модернизированная система будет лучше поддерживать будущие эксперименты по смешиванию двух образцов, аналогичные тем, о которых сообщалось ранее, а также анализы быстрого связывания, такие как между терапевтическим средством с малой молекулой и его белковой мишенью или даже образованием комплекса антитело-антиген. В то время как текущие и будущие эксперименты с временными решениями с участием двух взаимодействующих партнеров, безусловно, будут продолжаться, добавление третьего пьезоэлектрического дозатора и связанного с ним оборудования может еще больше расширить диапазон возможных экспериментов. Например, первоначальное осаждение моющего средства с последующим интересующим белком, за которым следует взаимодействующий или активирующий лиганд, может устранить любое потенциальное негативное воздействие длительного воздействия моющего средства, часто необходимое для предотвращения общих неоптимальных результатов визуализации, таких как предпочтительная ориентация. В свете как уже опубликованной работы, так и потенциальных будущих применений, Spotiton представляет собой важный инструмент для сообщества крио-ЭМ для облегчения проведения субсекундных исследований с временным разрешением.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Питера А. Кана и Терри Роде из Engineering Arts LLC (Аризона, США) за первоначальное проектирование и последующую разработку системы Spotiton. Мы благодарим сотрудников Центра электронной микроскопии Саймонса в Нью-Йоркском центре структурной биологии за помощь и техническую поддержку. Работа, представленная здесь, была проведена в Национальном ресурсе автоматизированной молекулярной микроскопии, расположенном в Нью-Йоркском центре структурной биологии, при поддержке грантов NIH (GM103310) и Фонда Саймонса (SF349247).
Materials
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
Referenzen
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -. E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
- Wei, H., et al. Optimizing “self-wicking” nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
