새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비
Summary
여기에 제시된 프로토콜은 새로운 로봇 시스템인 Spotiton의 사용을 설명하며, 액체 저온기에서 진동하기 전에 최소 90ms를 혼합하는 나노 와이어 그리드에 관심 있는 두 샘플을 전달합니다.
Abstract
두 개 이상의 상호 작용하는 입자의 초기 만남에 의해 트리거 단기 분자 상태의 캡처는 극저온 전자 현미경 검사 (극저온-EM)의 필드에 큰 관심의 실험 적인 도전이 계속. 이러한 “시간 해결” 연구를 지원하는 몇 가지 방법론 적 전략이 개발되었으며, 그 중 하나는 Spotiton-a 새로운 로봇 시스템으로 피콜리터 크기의 샘플 방울의 분배와 정밀한 시간적 및 공간 제어가 결합되어 있습니다. 시간 해결된 Spotiton 워크플로우는 최소한의 샘플 볼륨에서 초기 구조 재배열을 심문하는 고유하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 독립적으로 제어되는 압전 디스펜서에서 발사된 두 개의 샘플은 나노와이어 EM 그리드에서 빠르게 혼합되어 극저온을 향해 떨어지게 됩니다. 잠재적으로 수백 개의 그리드를 샘플의 몇 마이크로리터만 에서 빠르게 연속적으로 준비할 수 있습니다. 여기서, Spotiton 시스템의 작동에 대한 상세한 단계별 프로토콜은 그리드 준비 중에 발생하는 특정 문제를 해결하는 데 중점을 두고 있습니다.
Introduction
극저온-EM이 극저온-EM 그리드2를준비하기 위해 더보체트가 개발한 표준 플런지 동결 법에 기초한 베리만과 언윈1을 시작으로 여러 그룹에서 단백질의 일시적인 형성 상태를 포착하고 드러낼 수 있는 가능성을 입증하였다. 그들은 압축 질소 가스를 사용하여 두 번째 샘플의 미세한 안개를 얇은 수성 층에 적용하고 블랜트한 첫 번째 샘플을 포함하는 급락 EM 그리드에 분사하는 극저온 컵 바로 위에 분토제를 추가했습니다. 이 시스템은 1ms의 낮은 혼합 시간을 달성 할 수 있지만, 그것은 여전히 사용자가 기술적으로 도전적인 작업 -과 두 번째 샘플의 상대적으로 높은 볼륨에 의해 첫 번째 샘플의 수동 블로팅을 요구했다. 더욱이, 실제로, 두 샘플의 혼합이 어디에서 일어났는지 알기 어려웠으며, 혼합 시료의 서메이션 마커로서 페리틴 나노입자를 사용해야 했다. 하워드 화이트와 동료에 의한 후속 노력은 블로팅 및 스프레이 단계3,4의컴퓨터 제어를 통합하여이 살포 혼합 접근 법의 제어 및 재현성을 향상시켰습니다. 샘플이 얼마나 잘 혼합되는지 를 해결하기 위해 동일한 그룹5 및 기타6,7,8,9,10은 주사기 펌프의 압력하에 좁은 모세관 튜브 또는 질소 가스에 의해 구동되는 미세 섬유 칩에서 두 개의 샘플이 혼합되는 혼합 살포접근법(11)으로 이동했습니다. 이러한 프리믹싱 시스템은 완전한 혼합을 보장할 뿐만 아니라 믹싱 시간을 미세 조정하여 시간 해결 된 연구의 해상도를 높일 수 있습니다.
Spotiton 시스템에서 EM 그리드에 샘플을 적용하는 대체 방법으로 압조전 디스펜서를 도입함으로써 샘플 증착을 정밀하게 타겟팅하고 훨씬 더 작은 샘플 볼륨의 요구 사항을 모두 사용하여그리드(12)를만들 수 있습니다. 나중에, 나노와이어 그리드와 도중 시료 애플리케이션(“즉석” 스포팅)의 사용은 블로팅 단계의 필요성을 제거하고 적용-대 바이피션 시간13,14를감소시켰습니다. 여기에 설명된 시간 해결 극저온-EM에 대한 새로운 접근법의 경우, 필요한 제어 하드웨어 및 소프트웨어 업그레이드와 함께 두 번째 디스펜서가 Spotiton 시스템에 추가되어 처음15의증착 직후 움직이는 나노 와이어 그리드에 두 번째 샘플을 전달할 수 있게 되었다. 두 개의 겹치는 샘플은 나노 와이어에 의해 멸망되어 유리화 전에 얇은 수성 층으로 사악할 때 그리드에 혼합됩니다. 90ms의 낮은 혼합 시간을 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 압전 디스펜싱 및 나노 와이어 그리드를 사용하여 시간 해결 실험을 수행하는 방법에 대한 실용적인 정보를 제공 할 계획입니다. 또한 사용 편의성, 일관성 및 처리량을 향상시키기 위해 하드웨어 및 소프트웨어가 수정됨에 따라 이 프로토콜은 이전에 보고된메서드(15)에대한 최신 설명역할을 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 90-500 ms에 혼합된 2개의 견본, 일반적으로 관심있는 단백질 및 활성화 리간드를 전송하는 저온-EM 화상 진찰을 위한 그리드를 준비하기 위하여 Spotiton 로봇 시스템의 사용을 설명합니다. 워크플로우는 간단하지만 생산적인 그리드 메이킹 세션을 보장하기 위해 사용자가 염두에 두어야 하는 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 첫째, 압전 디스펜서 팁 중 하나가 막히거나 발사되지 못하도록 막는 것은 드문 일이 아닙니다. 이러한 오류로 인해 위쪽 또는 아래 카메라에서 이미지 캡처에서 볼 수 있는 액체 줄무늬가 발생하며, 이는 두 팁이 모두 발사된 후 볼 수 있는 것보다 눈에 띄게 좁습니다. 막힘은 끝에 있는 기포 숙박, 물방울 형성 을 방해하거나 좁은 팁 오리피스를 건조하고 밀봉한 단백질 샘플에서 발생할 수 있습니다. 흡입 된 샘플은 과정에서 손실되지만, 두 문제는 팁의 초음파 세척및 샘플의 재포부시에 의해 해결 될 수있다. 후속 막힘 및 샘플 폐기물을 방지하기 위해, 시료 포부 전에 유체 라인을 철저히 (플러시)하고 챔버 및 덮개 내에서 높고 일관된 습도 수준을 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 특히 농도가 높은 단백질 샘플은 습도가 잘 유지되음에도 불구하고 팁 발사에 영향을 줄 수 있습니다. 검사 탭에서 발사 진폭을 증가하면 고단백 농도로 인해 약한 발사를 부분적으로 보상할 수 있지만, 샘플을 1:2 이상 희석하면 팁 발사가 향상되고 막힘을 피할 수 있습니다.
둘째, 표적 혼합 지속 시간에 최적의 두께의 얼음을 생성하는 데 필요한 이상적인 위킹 속도를 달성하기 어려울 수 있습니다. 일반적으로, 더 빠른 혼합 시간은 더 빠른 사악이 필요합니다, 느린 혼합 시간은 느린 사브가 필요합니다. 이상적으로 사악한 그리드의 경우, 액체 줄무늬는 상부 카메라 이미지에서 명확하게 식별 할 수 있으며, 아래 카메라에는 줄무늬의 위치에있는 그리드 막대가 약간 두꺼워집니다. 낮은 카메라 이미지에 어두운 줄무늬로 표시된 느린 위킹은 일반적으로 이미징에 너무 두꺼운 얼음을 남깁니다. 양쪽 이미지에 줄무늬가 없으면 구멍에 물을 남기지 않았을 수 있는 빠른 위빙(그림S5)을나타냅니다. 나노 와이어 밀도, 플라즈마 세척 설정 및 지속 시간, 챔버 습도의 수준 및 설정 수준에 노출의 시간과 같은 몇 가지 요인은 사악 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. 불량 (느린) 위킹 그리드에 나노 와이어의 희소 코팅의 결과 일 수있다. 나노와이어용액(16)에대한 노출 시간을 약간 희석하고 증가시킴으로써 그리드 바의 나노와이어의 밀도와 커버리지가 증가하여 더 빠른 위력을 촉진합니다. 나노 와이어 밀도가 충분하면 플라즈마 세척의 와트 설정 또는 지속 시간을 늘리면 위킹이 향상됩니다. 여기에 권장되는 설정은 상대적으로 낮은 전력과 긴 기간이지만 필요한 경우 변경될 수 있습니다.
그러나, 그리드와 플라즈마 세척 설정의 특정 배치가 이전 세션에서 잘 작동한 경우, 느린 위빙 성능은 챔버 내의 높은 습도에 나노 와이어의 과도한 노출에서 발생할 수 있습니다, 수분과 감소 액체 보유 용량으로 자신의 포화로 이어지는. 챔버 습도의 그리드 포화 효과는 트위저 장착과 그리드 급락 사이의 경과 시간을 최소화하거나 급락 하기 전에 시스템 습도 수준을 감소시킴으로써 감소 될 수 있습니다. 그러나 후자는 단백질 샘플로 로드된 팁이 막힘일 관련 위험을 가져온다는 점에 유의해야 합니다. 이러한 위험을 상쇄하기 위해 습도수준이 높은 슈라우드의 팁을 보유하면 새 그리드를 들고 핀셋을 장착하는 데 허용되는 시간을 늘릴 수 있습니다. 마지막으로, 전력망 가속 및/또는 최대 속도를 증가시킴으로써 급락 시간이 감소하면 실제로 그리드의 위킹 특성을 변경하지 않으면서 얼음이 더 얇은 그리드가 발생할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 그러나 두 샘플의 혼합 시간도 감소하므로 급락 시간은 일반적으로 느린 담기를 해결하기 위해 변경되는 요인이 아닙니다. 너무 빠른 위킹을 해결하기 위해 그리드 구멍에 너무 얇거나 없는 얼음을 생성하여 위에서 설명한 조치의 반대값을 취할 수 있습니다.
Spotiton은 초시간 해결 연구를 위해 개발된 다른 기술과 비교할 때 특정 장점과 단점을 제시합니다. 혼합 시료 스트라이프는 각 디스펜서로부터 2-4nL의 액체만 함유되어 있기 때문에, 각 시료의 단일 3 μL 알리쿼트만으로도 샘플이 제한될 때 많은 그리드-주요 이점을 준비하기에 충분하다. 또한, Spotiton17에완전히 고유하지는 않지만 통합 카메라를 사용하여 샘플 증착을 관찰하는 것은 다른 믹싱 장치의 특징이 아니며 급락 된 그리드가 조잡한 패스 / 실패 평가를 받을 수 있으므로 선별 시간을 크게 줄입니다. 시스템의 한 가지 주요 단점은 기계 성분의 물리적 한계에 의해 제한되는 90 ms의 최소 혼합 시간이며, 이는 더 빠른 생물학적 반응에 대한 심문을 손이 닿지 않는 곳에 두는 것입니다. 이에 비해 기존 미세 유체 시스템에서 10ms 미만의 시간이 일상적으로 달성됩니다. Spotiton 기반의, 시판되는 카멜레온 시스템에서 설계 및 시공 개선은 최소 급락 시간을 54ms로 단축하고 두 번째 디스펜서를 추가하면 Spotiton이 현재 제공 할 수있는 것보다 더 빠른 혼합 시간을 허용할 수 있다는 가능성을 제기합니다.
현재까지 70S 리보솜의 조립, 칼슘 트리거된 반막 이온 채널의 칼슘 트리거 된 형태 변화, GTP 가수분해(15)에대한 응답으로 다이너민의 수축을 포함하여 Spotiton을 사용하여 초기, 단명 분자 상태를 조사하기 위한 다양한 실험이 수행되었다. 이러한 결과가 발표된 이후, 스팟톤 그리드 메이킹 세션의 처리량, 재현성 및 보고를 향상시키기 위해 시스템에 몇 가지 변경 사항이 통합되었습니다. 여기에는 이중 영역, 자동 습도 모니터링 및 제어 시스템, 실험 뷰어 기능, 나란히 팁 검사 기능 및 UI에 대한 몇 가지 사소한 업그레이드가 포함됩니다. 업그레이드된 시스템은 이전에 보고된 것과 유사한 미래의 2시 혼합 실험뿐만 아니라 소분자 치료와 단백질 표적 또는 항체-항원 복합 형성 과 같은 신속한 결합 소심을 더 잘 지원할 것입니다. 두 상호 작용 파트너와 관련된 현재 및 향후 시간 해결 실험은 확실히 계속될 것이지만, 세 번째 압전 디스펜서와 관련 하드웨어를 추가하면 가능한 실험 의 범위를 더욱 넓힐 수 있습니다. 예를 들어, 관심있는 단백질에 이어 세제의 초기 증착은 상호 작용 또는 활성화 리간드에 이어 세제에 대한 확장 된 노출의 잠재적 부정적인 영향을 제거 할 수 있으며, 종종 바람직한 방향과 같은 일반적인 최적이 아닌 이미징 결과를 방지하는 데 필요한. 이미 게시된 작업과 향후 잠재적 애플리케이션에 비추어 Spotiton은 극저온-EM 커뮤니티가 초중 시간 해결 연구의 수행을 용이하게 하는 중요한 도구를 나타냅니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 초기 디자인과 Spotiton 시스템의 후속 개발에 대한 엔지니어링 아트 LLC (애리조나, 미국)에서 피터 A. 칸과 테리 로데에게 감사드립니다. 우리는 도움과 기술 지원을 위해 뉴욕 구조 생물학 센터의 사이먼 전자 현미경 센터의 직원에게 감사드립니다. 여기에 제시 된 작품은 NIH (GM103310)와 시몬스 재단 (SF349247)의 보조금에 의해 지원, 뉴욕 구조 생물학 센터에 위치한 자동화 된 분자 현미경 검사법을위한 국가 자원에서 실시되었다.
Materials
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
Referenzen
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