新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備

1. Spotiton マシンとソフトウェアをセットアップする システムを分配する準備をします(図1)。 窒素供給タンクのメインバルブを開きます。システム貯蔵所が脱気、超純水で満たされていることを確認してください。コンピュータの電源を入れます。マルチアウトレット電源ストリップでSpotitonシステムをオンにします。 デスクトップアイコン (図 2A) をクリックして、Spotiton ソフトウェアのユーザー インターフェイス (UI) を開きます (図 2B)。[ツール]メニューで、[ステージを初期化]を選択して、3軸ロボット(グリッドステージとピペットステージ)と回転ディスペンサーヘッドアセンブリ(thetaステージ)を初期化してホームにします。初期化とホーミングの前にディスペンサーの先端が下向きになっていることを確認します。 メイン ウィンドウで、[ セーフポジションへ移動 ] をクリックして、ロボットを SafePosition に送信します (図 3)。メモ:SafePositionへの移動は、衝突の危険なしに任意の位置にあるロボットで行うことができます。 [ 吸気] タブで、[ プライム ] を選択して、ディスペンサーヘッドを貯水池の水で複数回洗い流します。2つの先端から途切れない水の流れが出てくるまで続けてください。注: 最後のシャットダウン時にチップがメタノールでフラッシュされたときに、かなりの量の空気が流体ラインに入った場合、この処理を繰り返す必要があります。 ディスペンサー性能の検査 [ 検査 ]タブで、各チップを検査カメラに送って水を試験し、2つのディスペンサー(図S1)からの液滴生産のパターンに一致させます。メモ:泡(図S2A)または破片のためにチップが発射されない場合は、吸気タブでアクセスする超音波洗浄機能を使用して、洗浄ステーション(図S2B)の先端を清掃してください。 各ディスペンサーとサンプルの焼成振幅(ユニットレス)を調整して、一貫したサイズの離散液滴の流れを達成します。 2つのディスペンサーによる同等の液滴の生産を視覚的に確認する。 上部のカメラモニターの「録画」ボタンを押して、チップ1発射の動画を録画します。先端2が上側カメラモニターで発射されると同時に、右側のモニターで発射するチップ1のビデオを再生します(図S1)。注:各チップ発射のビデオが記録され、保存されます。 ディスペンサーはグリッド上でテスト発射する準備が整いました。注: このプロトコルは、それぞれのプランジ位置でのグリッドとピペットの正しい位置合わせが検証されていることを前提としています。正しい位置合わせを確認しないと衝突が発生し、先端やロボットが損傷する可能性があります。 グリッド上の水をテストします。 ロボットがセーフポジションにあることを確認します。 付属のアレンキーを使用して、グリッドロボットのマウントからピンセットを取り外します。 近くのベンチトップで、テストグリッド、ナノワイヤー側をグリッドブロックの端に配置します。慎重にグリッドの縁をつかみ、ピンセット(図S3)に正しく配置し、ピンセットを取り付け直します。 [クライオ]タブで、[ヒントからカメラへ]をクリックして、上のプランジパスカメラ(上部カメラ)の視野にヒントを移動します。上側のカメラモニタでLiveが選択され、上側のカメラライトが点灯していることを確認します(マシンキャビネットの前面にダイヤルします(図1)。 グリッドロボットにピンセットを取り付ける。上側のカメラ モニタに表示されるヒント 1 を、モニタ内でマウスをクリックして配置します。注: ヒント 1 のみが表示され、クリックの位置に移動します。 [ グリッドからカメラへ] をクリックして、上のカメラの前にグリッドを配置します。必要に応じて、以前と同様にヒント1の位置を調整します。 [Tip1]、[Tip2]、[Tip1と Tip2]のいずれかを選択して、どちらか一方または両方のディスペンサーを選択してテスト・ファイアを実行します。 注: ヒントを個別にテストする場合は、マウスを使用して、グリッド上の別の横方向の位置に上側カメラモニターにヒント 1 を配置します。これにより、2つのチップから液体ストライプを重複しないパターンで堆積させ、各チップが発射されたことを確認することができます。 [ クライオ ] タブで 、[Vitrify Grid] が選択されていないことを確認し、[ キュー ターゲット] をクリックし、 プランジでクリックします。注:ピペットステージがわずかに上昇し、その後にグリッドステージが続きます。グリッドロボットは、発射ディスペンサーと上下のカメラを通り過ぎてグリッドを突っ込み、デッキのすぐ上で休むようになりました。上のカメラからの画像キャプチャは、UI の左側にある下側カメラからの画像キャプチャの上に表示されます。 上下の画像を評価する:各先端は選択されたときに発射されましたか?一緒に発射されたとき、2つの先端からの液体は完全に重なり、個別に発射されたときよりも著しく厚いストライプを作り出しましたか? いずれかの先端が発射に失敗した場合は、明確な発火が観察されるまで1つまたは複数の超音波洗浄サイクルを実行します。 サンプルストライプが完全に重ならない場合は、アレンキーを使用してディスペンサーの1つの横方向の位置合わせを調整して、ディスペンサーの1つの側面調整ネジを1/4ターン回転させ、テストプランジを実行します。ストライプが完全に重なるまで繰り返します。注: 両方のヒントが正常に起動し、期待どおりに起動した場合、システムはサンプル グリッドを準備する準備ができています。 2. 2サンプルの混合グリッドを用意する マシンパラメータXMLファイルの加速度、減速、速度の値を更新して、目的のミキシング時間を達成します。注: これらの値を混合時間に関連付けた表は、以前に15を報告されています。 サンプルとグリッドを準備します。注: プロトコルのこの時点から、最初のグリッドが準備される前に 20 ~ 30 分が経過し、サンプルはこの時間間隔の間、適切な温度で保持する必要があります。 適切な緩衝液を用いて目的の濃度に2つのサンプル(すなわち、タンパク質およびリガンドまたは他の相互作用パートナー)を希釈し、理想的には、両者について同じである。注:スポティトングリッドは、通常、自動プランジ冷凍庫に使用されるタンパク質の1.5〜2倍の濃度を必要とします。これは、急落時にタンパク質がグリッド表面の薄い水層で費やす時間が最も短いためであり、粒子が空気と水の界面に集中する機会を減らす可能性があります。 液体窒素でクライオゲンボウルを満たします。 プラズマクリーン3-4ナノワイヤグリッド。出発点として5W、水素、酸素を1.5分使用してください。注:最も効果的なプラズマ洗浄時間とレシピは、周囲の温度と湿度と使用されるナノワイヤグリッドのバッチに基づいて、日々の変化をすることができます。代替ガス混合物またはグロー放電器も有効であるかもしれないが、この目的のためにテストされていない。バッファー溶液中の水とタンパク質は、ナノワイヤによって異なる速度で悪振る舞うことが多いため、実際のサンプルが分配される急落時にその日に使用されるグリッドのウィッキングを評価することがベストプラクティスです。 システムの湿度レベルを設定します。注:グリッドを作り、プラズマの両方に使用される条件に加えて、湿度はナノワイヤグリッドのウィッキング速度に影響を与えるもう一つの主要な要因です。特定のセッションの目標%湿度は、毎日とグリッドのバッチごとに経験的に決定されますが、90〜95%が良い出発点です。 ネブライザーが超純水で十分に満たされていることを確認してください。ネブライザーを差し込み、ネブライザーキャップの中央ポートから蒸気出口を観察します。 メインウィンドウでライブ湿度モニタを観察するか、レポート|の下の周囲湿度トラッカーを開きます アンビエント (図 S4)2つのゾーンの湿度レベルを確認してください: チャンバー と シュラウド。注: チャンバー には、Spotitonエンクロージャ内のすべての領域が含まれています。 シュラウド は、グリッドとディスペンサーの先端の「カメラで」位置をすぐに包含する領域です。ブラック樹脂シュラウドは、エンクロージャドアが開いてグリッドをロードするときに、設定された湿度レベルを維持します。 目標の湿度値に達したら、これらの値を [ 湿度 ] タブから自動的に、または手動で維持します。[ 自動制御] を選択し、設定点としきい値を選択して、選択したしきい値の範囲内で設定ポイントを維持します。または、[ 手動制御] を選択し、 チャンバーファン と シュラウドファンの2つのファンコントロールを使用して湿度レベルを調整します。注:チャンバーファンをオンにすると、左ポートのフィルターを通して蒸気を引っ張り、より大きな水滴がチャンバーに入るのを防ぎ、周囲の湿度がさらに増加するのを防ぎます。チャンバードアが閉じたままである限り、湿度レベルは所望の割合で安定します。シュラウドファンをオンにすると、右のポートを通って蒸気がシュラウドに引き込まれる。これは両方ともチャンバーへの蒸気放出を減らし、シュラウド内の湿気レベルを増加させる。 サンプルをディスペンサーに積み込みます。 サンプルカップに各サンプルを5μL加えます。注:気泡を導入しないように、カップの内側の側壁に非常に慎重にボリュームを分配し、カップの底にサンプルを強制するために振り下ろします。 サンプルカップを保持トレイ(左側のチップ1のサンプル)に、右側のTip 2にセットします。トレイをマシンに押し込み、シートに戻します。 [ 吸気 ]タブで、各チップで吸引するボリュームに3μLを選択します。サンプルトレイがしっかりと固定されていることを確認し、 吸引 をクリックして、ピペットステージがディスペンサーヘッドをサンプルカップに移動する様子を観察します。 サンプルカップを取り外し、液面の低下を観察することで、両方のサンプルの吸引を確認します。 [ 検査 ]タブで、各チップを検査カメラに送信して、妨げられないディスペンスを確認します。各先端からの液滴の形成を一致させるために必要に応じて振幅を調整します(セクション1.2を参照)。注: タンパク質サンプルを分配するチップの振幅を大きくする必要があります。 これで、システムはサンプルグリッドを準備する準備が整いました。 サンプル グリッドをフリーズする 新しくプラズマ洗浄されたグリッドをピンセットにロードしますが、ピンセットはまだ取り付けないでください。湿度レベルが上昇していることを確認します, 〜90-95%.エタンカップを満たします。 点検カメラの前で両方の先端の最終試験射撃を行い、障害物がないことを確認します。[クライオ] タブで、[ カメラへのヒント] をクリックします。 エタンカップを満たします。エタン氷が形成される場合は、必要に応じてエタンガスを加えて溶融します。注:ステップ2.5.4および2.5.5は比較的速く(<20 s)チャンバの高湿度のナノワイヤの飽和を最小にし、(ii)タンパク質サンプルを焼成する先端が詰まらせる可能性を達成する必要があります。 グリッドステージにグリッドを持つピンセットをマウントします。[ クライオ ] タブで、[ グリッドからカメラ]をクリックします。ヒント1が上側のカメラモニタに正しく配置されていることを確認します(手順1.3.4~1.3.5を参照)。 [ ビトリフィ グリッド]、[ キュー ターゲット]、[ プランジ] の順にクリックします。グリッドロボットにエタンから液体窒素にグリッドをホップし、水没した棚に放出するように指示されたら 、[OK]を クリックします。注:ピンセットは、その後、チャンバーに戻って上昇します。液体窒素へのホップの後、グリッドがピンセットから落ちたかどうかを尋ねるプロンプトが表示されます。ドロップされなかった場合は、[ いいえ] をクリックすると、ピンセットが数回開いて閉じてグリッドを切り離します。 グリッドのイメージ (図 S5) を調べて、グリッドを保持するか破棄するかを決定します。 グリッドを保持する場合は、事前に冷却されたグリッド ボックスに転送します。また、後続のグリッドを見つけて、すべてのグリッドをグリッドボックスに一度に転送し、各グリッドを休憩エリア内の位置で識別できるように注意します。 グリッドをグリッドボックスに転送するには、細かいチップの鉗子を事前に冷却し、グリッドを端でそっとつかみ、時計回りに行くノッチの最初のスロットから始めてグリッドボックススロットに配置します。 すべてのグリッドがロードされたら、グリッドボックスの蓋を蓋ツールに取り付け、液体窒素で予冷します。ふたをグリッドボックスにねじ込み、蓋ツールまたはプリクールスクリュードライバーで締めます。 大きな鉗子を使用して、閉じたグリッドボックスをイメージングまたは長期保存のための小さなデュワーに素早く転送します。 下流のEMイメージングに対するグリッド適合性を評価します。 グリッドが突っ込んだ直後に UI の左側に表示される上および下のプランジ パス カメラの画像を観察します。これらの画像を使用して、ウィッキング速度、両方の先端の発射に成功し、2つのサンプルストライプのオーバーラップの程度を評価します。 実験ビューアを使用して、プランジ時のマシン設定と湿度測定と共に、上下のカメラのグリッド画像を確認し、比較します |。実験を行う. 良いウィッキングの証拠を示す電子顕微鏡でイメージング用のグリッドを選択します。