Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton
Summary
Il protocollo qui presentato descrive l’uso di Spotiton, un nuovo sistema robotico, per fornire due campioni di interesse su una griglia di nanofili auto-traspiranti che si mescolano per un minimo di 90 ms prima della vetrificazione nel criogeno liquido.
Abstract
La cattura di stati molecolari di breve durata innescati dall’incontro precoce di due o più particelle interagenti continua ad essere una sfida sperimentale di grande interesse nel campo della crio-microscopia elettronica (cryo-EM). Sono state sviluppate alcune strategie metodologiche che supportano questi studi “risolti nel tempo”, uno dei quali, Spotiton – un nuovo sistema robotico – combina l’erogazione di goccioline campione di dimensioni picoliter con un preciso controllo temporale e spaziale. Il flusso di lavoro Spotiton risolto nel tempo offre un approccio straordinariamente efficiente per interrogare i primi riarrangiamenti strutturali da un volume minimo di campioni. Sparati da distributori piezoelettrici controllati in modo indipendente, due campioni atterrano e si mescolano rapidamente su una griglia EM a nanofili mentre si tuffa verso il criogeno. Potenzialmente centinaia di griglie possono essere preparate in rapida successione da pochi microlitri di un campione. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato passo-passo del funzionamento del sistema Spotiton con particolare attenzione alla risoluzione di problemi specifici che sorgono durante la preparazione della griglia.
Introduction
Il potenziale per la crio-EM di catturare e rivelare stati conformazionali transitori delle proteine sulla scala temporale al di sotto del secondo (cryo-EM risolta nel tempo) è stato realizzato da diversi gruppi, a partire da Berriman e Unwin1 la cui tecnica si è basata sul metodo standard di congelamento a tuffo sviluppato da Dubochet per la preparazione di griglie crio-EM2. Hanno aggiunto un atomizzatore appena sopra la tazza di criogeno che utilizzava gas azoto compresso per spruzzare una nebbia fine di un secondo campione su una griglia EM immersa contenente un primo campione che era stato applicato e cancellato su un sottile strato acquoso. Sebbene questo sistema potesse raggiungere tempi di miscelazione fino a 1 ms, richiedeva comunque il blotting manuale del primo campione da parte dell’utente – un compito tecnicamente impegnativo – e un volume relativamente elevato del secondo campione. Inoltre, in pratica, era difficile sapere dove fosse avvenuta la miscelazione dei due campioni, richiedendo l’uso di nanoparticelle di ferritina come marcatore fiduciale nel campione misto. Gli sforzi successivi di Howard White e colleghi hanno migliorato il controllo e la riproducibilità di questo approccio di spruzzatura-miscelazione incorporando il controllo computerizzato delle fasi di blotting e spruzzatura3,4. Per affrontare il modo in cui i campioni si mescolano, lo stesso gruppo5 e altri6,7,8,9,10 sono passati a un approccio di miscelazione-spruzzatura11 in cui due campioni vengono miscelati in stretti tubi capillari sotto la pressione di pompe a siringa o in chip microfabbricati e microfluidici azionati da gas di azoto. Questi sistemi di premiscelazione non solo garantiscono una miscelazione completa, ma consentono anche la messa a punto dei tempi di miscelazione per aumentare la risoluzione degli studi risolti nel tempo.
L’introduzione di erogatori piezoelettrici come modo alternativo per applicare il campione alle griglie EM nel sistema Spotiton ha permesso sia il targeting preciso della deposizione del campione sia il requisito di un volume di campione molto più piccolo per creare una griglia12. Successivamente, l’uso di griglie di nanofili e l’applicazione di campioni in rotta (spotting “al volo”) ha eliminato la necessità di una fase di blotting e ridotto i tempi da applicazione a vetrificazione13,14. Per il nuovo approccio alla crio-EM risolta nel tempo qui descritto, un secondo distributore insieme ai necessari aggiornamenti hardware e software di controllo sono stati aggiunti al sistema Spotiton per consentire la consegna di un secondo campione su una griglia di nanofili in movimento quasi immediatamente dopo la deposizione dei primi15. I due campioni sovrapposti si mescolano sulla griglia mentre sono malvagi dai nanofili in un sottile strato acquoso prima della vetrificazione. È possibile ottenere tempi di miscelazione fino a 90 ms. Questo protocollo intende fornire informazioni pratiche su come condurre esperimenti risolti nel tempo utilizzando l’erogazione piezoelettrica e le griglie di nanofili. Inoltre, poiché l’hardware e il software vengono modificati per migliorare la facilità d’uso, la coerenza e la velocità effettiva, questo protocollo funge anche da descrizione aggiornata del metodo15precedentemente riportato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo delinea l’uso del sistema robotico Spotiton per preparare griglie per l’imaging crio-EM che trasportano due campioni, generalmente una proteina di interesse e un ligando attivante, che sono stati miscelati per 90-500 ms. Sebbene il flusso di lavoro sia semplice, ci sono alcune considerazioni che l’utente deve tenere a mente per garantire una sessione di creazione di griglia produttiva. Innanzitutto, non è raro che una delle punte del distributore piezoelettrico si intasi o si blocchi impedendone lo sparo. Tale guasto si tradurrà in una striscia liquida, vista sulle acquisizioni di immagini dalla fotocamera superiore o inferiore, che è visibilmente più stretta di quella vista dopo che entrambe le punte sono sparate. Un blocco potrebbe derivare da una bolla d’aria che si insegna nella punta, interrompendo la formazione di goccioline, o da un campione proteico che si è asciugato e ha sigillato l’orifizio della punta stretta. Sebbene il campione aspirato venga perso nel processo, entrambi i problemi possono essere risolti con un lavaggio ad ultrasuoni delle punte e una rias aspirazione del campione. Per evitare successivi intasamenti e sprechi di campioni, è fondamentale innescare accuratamente (lavare) le linee del fluido prima dell’aspirazione del campione e mantenere un livello di umidità elevato e costante all’interno della camera e del sudario. Inoltre, un campione proteico con una concentrazione particolarmente elevata può influenzare la cottura della punta nonostante l’umidità ben mantenuta. Sebbene l’aumento dell’ampiezza di cottura sulla linguetta Inspect possa parzialmente compensare la cottura debole dovuta all’elevata concentrazione di proteine, diluire il campione di almeno 1:2 migliorerà la cottura della punta ed eviterà l’intasamento.
In secondo luogo, può essere difficile raggiungere la velocità di traspirazione ideale necessaria per generare ghiaccio di spessore ottimale per la durata di miscelazione prevista. Generalmente, tempi di miscelazione più rapidi richiedono un assorbimento più rapido, tempi di miscelazione più lenti richiedono un assorbimento più lento. Per la griglia idealmente malvagia, una striscia liquida è chiaramente distinguibile nell’immagine superiore della fotocamera, mentre nella fotocamera inferiore rimane visibile solo un leggero ispessimento delle barre della griglia nella posizione della striscia. L’assorbimento lento, indicato da una striscia scura sull’immagine inferiore della fotocamera, generalmente lascia ghiaccio troppo spesso per l’imaging. L’assenza di una striscia su entrambe le immagini indica un traspirante veloce che potrebbe non aver lasciato acqua nei fori (Figura S5). Diversi fattori come la densità dei nanofili, le impostazioni e la durata della pulizia del plasma e il tempo di esposizione e il livello impostato di umidità della camera possono influenzare la velocità di assorbimento. Una scarsa (lenta) traspirazione può essere il risultato di un rivestimento sparso di nanofili sulla griglia. Diluendo leggermente e aumentando il tempo di esposizione alla soluzione di nanofili16, la densità e la copertura dei nanofili sulle barre della griglia aumenteranno, facilitando una traspirazione più rapida. Se la densità del nanofilo è sufficiente, aumentare l’impostazione della potenza o la durata della pulizia al plasma migliorerà anche l’assorbimento. Le impostazioni consigliate qui sono relativamente a bassa potenza e lunga durata, ma possono essere modificate se necessario.
Tuttavia, se sia il lotto specifico di griglie che le impostazioni di pulizia del plasma hanno funzionato bene in una sessione precedente, le prestazioni di assorbimento lento possono derivare da un’eccessiva esposizione dei nanofili a un’elevata umidità all’interno della camera, portando alla loro saturazione con umidità e ridotta capacità di trattenere i liquidi. L’effetto di saturazione della griglia dell’umidità della camera può essere ridotto riducendo al minimo il tempo trascorso tra il montaggio della pinzetta e l’immersione della griglia o diminuendo il livello di umidità del sistema prima di un tuffo. Va notato, tuttavia, che quest’ultimo comporta il rischio associato che la punta caricata con il campione proteico si ostruisa. Per compensare questo rischio, tenere le punte nel sudario dove viene mantenuto un alto livello di umidità, può aumentare la quantità di tempo consentita per montare una pinzetta che tiene una nuova griglia. Infine, va notato che un tempo di immersione ridotto (ottenuto aumentando l’accelerazione della griglia e / o la velocità massima) può portare a griglie con ghiaccio più sottile senza effettivamente modificare le caratteristiche di assorbimento della griglia. Tuttavia, poiché anche il tempo di miscelazione dei due campioni sarà ridotto, il tempo di immersione non è un fattore che viene in genere modificato per affrontare l’assorbimento lento. Per affrontare l’assorbimento troppo veloce, con conseguente ghiaccio troppo sottile o assente nei fori della griglia, è possibile adottare l’opposto delle misure sopra descritte.
Spotiton presenta alcuni vantaggi e svantaggi rispetto ad altre tecniche sviluppate per studi risolti nel tempo al di sotto del secondo. Poiché la striscia di campione mista contiene solo 2-4 nL di liquido da ciascun distributore, una singola aliquota di 3 μL di ciascun campione è sufficiente per preparare molte griglie, un vantaggio chiave quando il campione è limitato. Inoltre, l’osservazione della deposizione del campione utilizzando telecamere integrate, sebbene non del tutto esclusiva di Spotiton17,non è una caratteristica di altri dispositivi di miscelazione e consente alle griglie immerse di essere sottoposte a una valutazione pass/fail grezza, riducendo notevolmente i tempi di screening. Uno svantaggio chiave del sistema è un tempo minimo di miscelazione di 90 ms, limitato dalle limitazioni fisiche dei componenti meccanici, che mette fuori portata l’interrogazione di reazioni biologiche più veloci. In confronto, i tempi inferiori a 10 ms vengono regolarmente raggiunti su sistemi microfluidici esistenti. Sul sistema chameleon basato su Spotiton, disponibile in commercio, i miglioramenti di progettazione e costruzione hanno ridotto il tempo minimo di immersione a 54 ms e aumentato la possibilità che l’aggiunta di un secondo distributore possa consentire tempi di miscelazione più rapidi di quelli attualmente offerti da Spotiton.
Ad oggi, è stata condotta una serie di esperimenti per studiare stati molecolari precoci e di breve durata utilizzando Spotiton, tra cui l’assemblaggio del ribosoma 70S, i cambiamenti conformazionali innescati dal calcio in un canale ionico transmembrana e la costrizione della dinamina in risposta all’idrolisi GTP15. Dalla pubblicazione di questi risultati, sono state incorporate diverse modifiche al sistema per migliorare il throughput, la riproducibilità e la reportistica delle sessioni di creazione della griglia Spotiton. Questi includono, tra gli altri, il sistema di monitoraggio e controllo automatico dell’umidità a doppia zona, la funzione di visualizzazione dell’esperimento, la funzione di ispezione della punta affiancata e diversi aggiornamenti minori all’interfaccia utente. Il sistema aggiornato supporterà meglio i futuri esperimenti di miscelazione a due campioni simili a quelli precedentemente riportati, nonché i saggi di legame rapido come tra una terapia a piccola molecola e il suo bersaglio proteico o persino la formazione di complessi anticorpo-antigene. Mentre gli esperimenti attuali e futuri risolti nel tempo che coinvolgono due partner interagenti continueranno sicuramente, l’aggiunta di un terzo distributore piezoelettrico e dell’hardware associato potrebbe ampliare ulteriormente la gamma di possibili esperimenti. Ad esempio, la deposizione iniziale di un detergente seguita dalla proteina di interesse, seguita dal ligando interagente o attivante, potrebbe rimuovere qualsiasi potenziale impatto negativo dell’esposizione prolungata al detergente, spesso necessario per prevenire risultati di imaging non ottimali comuni come l’orientamento preferito. Alla luce sia del lavoro già pubblicato che delle potenziali applicazioni future, Spotiton rappresenta uno strumento importante per la comunità crio-EM per facilitare la conduzione di studi risolti nel tempo al di sotto del secondo.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Peter A. Kahn e Terry Rohde di Engineering Arts LLC (Arizona, USA) per la progettazione iniziale e il successivo sviluppo del sistema Spotiton. Ringraziamo lo staff del Simons Electron Microscopy Center presso il New York Structural Biology Center per l’aiuto e il supporto tecnico. Il lavoro qui presentato è stato condotto presso la National Resource for Automated Molecular Microscopy situata presso il New York Structural Biology Center, supportato da sovvenzioni del NIH (GM103310) e della Simons Foundation (SF349247).
Materials
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
Referenzen
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