הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton
Summary
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את השימוש ב- Spotiton, מערכת רובוטית חדשנית, כדי לספק שתי דוגמאות של עניין על רשת ננו-חוטים עצמית המערבבת לפחות 90 אלפיות השנייה לפני vitrification בקריוגן נוזלי.
Abstract
לכידת מצבים מולקולריים קצרי מועד המופעלים על ידי המפגש המוקדם של שני חלקיקים אינטראקציה או יותר ממשיכה להיות אתגר ניסיוני של עניין רב לתחום המיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM). פותחו כמה אסטרטגיות מתודולוגיות התומכות במחקרים “שנפתרו בזמן”, שאחד מהם, Spotiton- מערכת רובוטית חדשנית – משלב את חלוקת טיפות הדגימה בגודל פיקוליטר עם שליטה זמנית ומרחבית מדויקת. זרימת העבודה של Spotiton שנפתרה בזמן מציעה גישה יעילה וייחודית לחקור סידורים מבניים מוקדמים מנפח דגימה מינימלי. מפוטר ממתקני פיזואלקטריים בשליטה עצמאית, שתי דגימות נוחתות ומתערבבות במהירות על רשת EM ננו-חוטית כשהיא צוללת לכיוון הקריוגן. מאות רשתות פוטנציאליות יכולות להיות מוכנות ברצף מהיר מכמה מיקרוליטרים של מדגם. כאן, פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב של הפעולה של מערכת Spotiton מוצג עם דגש על פתרון בעיות ספציפיות המתעוררות במהלך הכנת הרשת.
Introduction
הפוטנציאל של cryo-EM ללכוד ולחשוף מצבים קונפורמציה ארעית של חלבונים בציר הזמן תת שנייה (זמן נפתר cryo-EM) מומש על ידי מספר קבוצות, החל ברימן ו Unwin1 אשר הטכניקה שנבנתה על שיטת הקפאת הצלילה הסטנדרטית שפותחה על ידי Dubochet להכנת רשתות cryo-EM2. הם הוסיפו אטומיזר ממש מעל הקריוגן שהשתמש בגז חנקן דחוס כדי לרסס ערפל דק של דגימה שנייה על רשת EM צוללת המכילה דגימה ראשונה שהוחלה ונמחקה לשכבה מימית דקה. למרות שמערכת זו יכולה להשיג זמני ערבוב נמוכים כמו 1 אלפיות השנייה, היא עדיין דרשה חבטה ידנית של המדגם הראשון על ידי המשתמש – משימה מאתגרת מבחינה טכנית – ונפח גבוה יחסית של המדגם השני. יתר על כן, בפועל, היה קשה לדעת היכן התרחש ערבוב של שתי הדגימות, הדורש שימוש בננו-חלקיקי פריטין כסמן פי דו-שנתי במדגם המעורב. מאמצים מאוחרים יותר של הווארד ווייט ושותפיו לעבודה שיפרו את השליטה והשחזור של גישה זו של ריסוס ערבוב על ידי שילוב שליטה במחשב של השלבים3,4. כדי לטפל כמה טוב ואיפה הדגימות לערבב, אותה קבוצה5 ואחרים6,7,8,9,10 עברו לגישה ערבוב ריסוס11 שבו שתי דגימות מעורבבות או צינורות נימים צרים תחת הלחץ של משאבות מזרק או שבבים microfabricated, מיקרופלואידי מונע על ידי גז חנקן. מערכות premixing אלה לא רק להבטיח ערבוב מלא, אלא גם לאפשר כוונון עדין של זמני ערבוב כדי להגדיל את הרזולוציה של מחקרים שנפתרו בזמן.
כניסתם של מכשירי פיזואלקטריים כדרך חלופית להחיל מדגם על רשתות EM במערכת Spotiton אפשרה הן פילוח מדויק של תצהיר מדגם והן דרישה של נפח מדגם קטן בהרבה כדי להפוך את רשת12. מאוחר יותר, השימוש ברשתות ננו-חוטים ויישום לדוגמה בדרך (“תוך כדי תנועה” תצפית) הסיר את הצורך בשלב סופג וצמצם את היישום-ל-vitrification כפול13,14. עבור הגישה החדשה להקפאה-EM שנפתרה בזמן המתוארת כאן, מתקן שני יחד עם חומרת הבקרה הדרושה ושדרוגי תוכנה נוספו למערכת Spotiton כדי לאפשר משלוח של דגימה שנייה לרשת ננו-חוט נעה כמעט מיד לאחר התצהיר של15הראשונים . שתי הדגימות החופפות מתערבבות על הרשת מכיוון שהן מרושעות על ידי הננו-חוטים לשכבה מימית דקה לפני ההחלמה. ערבוב פעמים נמוך ככל 90 ms ניתן להשיג. פרוטוקול זה נועד לספק מידע מעשי לגבי אופן ביצוע ניסויים שנפתרו בזמן באמצעות חלוקה פיזואלקטרית ורשתות ננו-חוטים. בנוסף, כאשר החומרה והתוכנה משתנות כדי לשפר את קלות השימוש, העקביות והתפוקה, פרוטוקול זה משמש גם כתיאור עדכני של השיטה15שדווחה קודם לכן .
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת הרובוטית Spotiton להכנת רשתות להדמיה קריו-EM הנושאות שתי דגימות, בדרך כלל חלבון מעניין ולגנד מפעיל, שהיו מעורבים במשך 90-500 אלפיות השנייה. למרות שזרימת העבודה פשוטה, ישנם מספר שיקולים שהמשתמש חייב לזכור כדי להבטיח הפעלת ייצור רשת פרודוקטיבית. ראשית, זה לא נדיר עבור אחד טיפים מתקן piezoelectric להיות סתום או חסום מניעת הירי. כישלון כזה יגרום פס נוזלי, לראות על לכידות תמונה מהמצלמה העליונה או התחתונה, אשר צרה בעליל מזו שנראית לאחר שני הטיפים שנורו. חסימה יכולה לנבוע מלינה של בועת אוויר בקצה, משבשת את היווצרות הטיפות, או מדגם חלבון שהתייבש ואטם את פתח הקצה הצר. למרות המדגם שאפתן הולך לאיבוד בתהליך, שתי הבעיות ניתן לפתור על ידי לשטוף קולי של טיפים ושאיפה מחדש של המדגם. כדי למנוע סתימה ופסולת מדגם לאחר מכן, חיוני כדי טאג”י (סומק) של קווי הנוזלים לפני שאיפת המדגם ולשמור על רמת לחות גבוהה ועקבית בתוך התא והתכריכים. בנוסף, דגימת חלבון עם ריכוז גבוה במיוחד יכולה להשפיע על ירי טיפים למרות לחות מתוחזקת היטב. למרות שהגדלת משרעת הירי בכרטיסייה Inspect יכולה לפצות חלקית על ירי חלש בשל ריכוז חלבון גבוה, דילול המדגם לפחות 1:2 ישפר את ירי הטיפים וימנע סתימה.
שנית, זה יכול להיות קשה להשיג את מהירות פתיל אידיאלי כי הוא נחוץ כדי ליצור קרח של עובי אופטימלי עבור משך ערבוב ממוקד. בדרך כלל, זמני ערבוב מהירים יותר ידרשו פתילות מהירה יותר, זמני ערבוב איטיים יותר דורשים פתילות איטית יותר. עבור הרשת המרושעת באופן אידיאלי, פס נוזלי ניכר בבירור בתמונת המצלמה העליונה, ואילו במצלמה התחתונה, רק עיבוי קל מאוד של מוטות הרשת במיקום הפס נשאר גלוי. פתילות איטית, המצוינת על ידי פס כהה בתמונת המצלמה התחתונה, משאירה בדרך כלל קרח עבה מדי להדמיה. היעדר פס בכל אחת מהתמונות מצביע על פתילות מהירה שאולי לא הותירה מים בבורות(איור S5). מספר גורמים כגון צפיפות ננו-חוט, הגדרות ניקוי פלזמה ומשך זמן, וזמן החשיפה לרמה שנקבעה של לחות החדר יכול להשפיע על מהירות מנדף. מנדטים גרועים (איטיים) עשויים להיות תוצאה של ציפוי דליל של ננו-חוטים ברשת. על ידי דילול מעט והגדלת זמן החשיפה לפתרון nanowire16, הצפיפות והכיסוי של ננו-חוטים על סרגלי הרשת יגדלו, מה שמקל על פתילות מהירה יותר. אם צפיפות nanowire מספיק, הגדלת הגדרת ההספק או משך ניקוי פלזמה ישפר גם את פתיל. ההגדרות המומלצות כאן הן בעלות הספק נמוך יחסית ומשך זמן ארוך, אך עשויות להשתנות במידת הצורך.
עם זאת, אם הן אצווה ספציפית של רשתות והגדרות ניקוי פלזמה עבדו היטב בפגישה קודמת, ביצועים מנדפים איטיים עשויים לנבוע מחשיפה מוגזמת של nanowires ללחות גבוהה בתוך התא, מה שמוביל לרוויה שלהם עם לחות ויכולת החזקת נוזל מופחתת. ניתן להפחית את ההשפעה הרוויה של לחות החדר על ידי מזעור הזמן שחלף בין הרכבת פינצטה וצלילה ברשת או הפחתת רמת הלחות של המערכת לפני הצלילה. יש לציין, עם זאת, כי האחרון מביא את הסיכון הנלווה כי הקצה טעון עם דגימת חלבון יהיה סתימה. כדי לקזז את הסיכון הזה, החזקת הטיפים בתכריכים שבהם נשמרת רמת לחות גבוהה, יכול להגדיל את משך הזמן המותר להרכבה פינצטה מחזיק רשת חדשה. לבסוף, יש לציין כי זמן צלילה מופחת (מושגת על ידי הגדלת האצת הרשת ו /או מהירות מקסימלית) יכול לגרום לרשתות עם קרח דק מבלי לשנות בפועל את המאפיינים המנדדים של הרשת. עם זאת, כמו זמן ערבוב של שתי הדגימות גם יצומצם, זמן צלילה אינו גורם כי הוא השתנה בדרך כלל כדי לטפל פתיל איטי. כדי לטפל במנדטים מהירים מדי, וכתוצאה מכך קרח דק מדי או נעדר בחורי הרשת, ניתן לנקוט את ההפך מהצעדים שתוארו לעיל.
Spotiton מציג יתרונות וחסרונות מסוימים בהשוואה לטכניקות אחרות שפותחו עבור מחקרים שנפתרו בזמן תת-שניות. כמו פס מדגם מעורב מכיל רק 2-4 nL של נוזל מכל מתקן, aliquot יחיד 3 μL של כל מדגם מספיק כדי להכין רשתות רבות – יתרון מפתח כאשר המדגם מוגבל. בנוסף, התבוננות בתצהיר מדגם באמצעות מצלמות משולבות, אם כי לא לגמרי ייחודי Spotiton17, אינו תכונה של מכשירי ערבוב אחרים ומאפשר רשתות צלליות להיות נתון להערכת מעבר גס / להיכשל, צמצום משמעותי של זמן ההקרנה. חיסרון מרכזי אחד של המערכת הוא זמן ערבוב מינימלי של 90 אלפיות שני, מוגבל על ידי המגבלות הפיזיות של הרכיבים המכניים, המציב חקירה של תגובות ביולוגיות מהירות יותר מחוץ להישג יד. לשם השוואה, פעמים פחות מ 10 ms מושגים באופן שגרתי על מערכות מיקרופלואידיות קיימות. במערכת הזיקית המבוססת על Spotiton, הזמינה מסחרית, שיפורי תכנון ובנייה צמצמו את זמן הצלילה המינימלי ל-54 אלפיות השנייה ומעלה את האפשרות שתוספת של מתקן שני יכולה לאפשר זמני ערבוב מהירים יותר ממה שספוטיטון יכולה להציע כעת.
עד כה, מגוון של ניסויים נערך כדי לחקור מוקדם, מצבים מולקולריים קצרי מועד באמצעות Spotiton, כולל הרכבה של ריבוזום 70S, שינויים קונפורמציה מופעל סידן בערוץ יונים transmembrane, וכיווצ של דינמין בתגובה GTP הידרוליזה15. מאז פרסום תוצאות אלה, שולבו במערכת מספר שינויים כדי לשפר את התפוקה, השכפול והדיווח של מפגשי יצירת רשת Spotiton. אלה כוללים, בין היתר, את האזור הכפול, מערכת ניטור ובקרת לחות אוטומטית, תכונת מציג הניסוי, תכונת בדיקת הטיפים זה לצד זה ומספר שדרוגים קלים לממשק המשתמש. המערכת המשודרגת תתמוך טוב יותר בניסויי ערבוב עתידיים של שתי דוגמאות בדומה לאלו שדווחו בעבר, כמו גם בבדיקות כריכה מהירות כגון בין טיפול במולקולה קטנה לבין יעד החלבון שלו או אפילו היווצרות קומפלקס אנטיגן נוגדנים. בעוד שניסויים עדכניים ועתידיים שנפתרו בזמן הכוללים שני שותפים אינטראקציה בהחלט יימשכו, תוספת של מתקן פיזואלקטרי שלישי וחומרה נלווית עשויה להרחיב עוד יותר את טווח הניסויים האפשריים. לדוגמה, תצהיר ראשוני של חומר ניקוי ואחריו חלבון של עניין, ואחריו אינטראקציה או הפעלת ליגנד יכול להסיר כל השפעה שלילית פוטנציאלית של חשיפה ממושכת חומר הניקוי, לעתים קרובות הכרחי כדי למנוע תוצאות הדמיה תת-אופטימלית נפוצות כגון אוריינטציה מועדפת. לאור העבודה שכבר פורסמה והן יישומים עתידיים פוטנציאליים, Spotiton מייצג כלי חשוב עבור קהילת cryo-EM כדי להקל על ביצוע מחקרים שנפתרו בזמן תת-שניות.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לפיטר קאהן וטרי רודה בהנדסה ארטס LLC (אריזונה, ארה”ב) על התכנון הראשוני והפיתוח הבא של מערכת Spotiton. אנו מודים לצוות המרכז למיקרוסקופיה אלקטרונית סימונס במרכז לביולוגיה מבנית בניו יורק על עזרה ותמיכה טכנית. העבודה המוצגת כאן נערכה במשאב הלאומי למיקרוסקופיה מולקולרית אוטומטית הממוקמת במרכז לביולוגיה מבנית בניו יורק, בתמיכת מענקים מ- NIH (GM103310) וקרן סימונס (SF349247).
Materials
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
Referenzen
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -. E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
- Wei, H., et al. Optimizing “self-wicking” nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
