使用新型机器人系统 Spotiton 进行时间解决研究的低温电子微观网格准备

1. 设置斯波蒂顿机器和软件 准备系统分配（图1）。 打开氮气供应罐上的主阀。确保系统储层充满脱气超纯水。打开计算机。在多出电源条纹上打开 Spotiton 系统。 单击桌面图标（图 2A）以打开 Spotiton 软件 （图 2B）的用户界面 （UI）。在工具菜单中，选择初始化阶段，以初始化和家用 3 轴机器人（网格级和移液器级）和旋转分配器头装配（该阶段）。确保分配器提示在初始化和归入之前指向下。 在主窗口上，单击”转到安全定位”将机器人发送到安全定位（图3）。注意：移动到安全定位可以在任何位置的机器人上完成，而不会有碰撞的风险。 在 吸气 标签上，选择 Prime 将分配器头多次冲洗到水库中的水中。继续，直到从这两个提示中可以看到不间断的水流。注：如果大量空气在上次关闭时用甲醇冲洗时进入流体线，则可能需要重复此情况。 检查分配器性能 在检查选项卡上，将每个提示发送到检查摄像机以测试火水，并匹配两个分配器的滴流生产模式（图 S1）。注意：如果由于气泡（图 S2A）或碎屑而无法开火，请使用Aspirate选项卡上访问的超声波洗涤功能在洗涤站（图 S2B）清洁尖端。 调整每个分配器和样品的发射振幅（无单位），以实现一致大小的离散液滴流。 视觉上确认两个分配器的等效滴滴生产。 按上部摄像机监视器中的 “记录 “按钮以录制提示 1 发射的视频。在右侧监视器中播放提示 1 射击的视频，同时在上部摄像机监视器（图 S1）中播放提示 2。注：记录并存储每个尖端射击的视频。 分配器现已准备好在网格上试火。注：此协议假定在各自的暴跌位置正确对齐网格和移液器阶段已得到验证。如果无法确认正确的对齐，可能会导致碰撞，损坏尖端或机器人。 网格上的试火水。 确保机器人处于安全定位。 使用提供的 Allen 密钥从网格机器人的安装件中取出钳子。 在附近的台面上，将测试网格放置在网格块边缘的纳米线侧面。小心地抓住网格的边缘，正确地放置在钳子（图S3），并重新安装钳子。 在Cryo选项卡上，单击”提示到相机”，将提示移入上跳路径摄像头（上部摄像头）的视图区域。确保在上部摄像机监视器中选择Live，并打开上部摄像机灯（在机柜前拨号（图 1）。 将钳子安装在网格机器人上。位置提示 1，通过单击监视器内的鼠标在上部摄像机监视器中可见。注意：只有提示 1 将可见，并将移动到单击的位置。 单击 “网格到相机 “以将网格放置在上置摄像头前方。如果需要，调整提示 1 位置，如有必要。 选择提示 1、提示 2或提示 1 和提示 2来选择一个或两个分配器来测试火。注：单独试用提示时，使用鼠标将提示 1 放置在上置摄像机监视器中网格上的不同横向位置。这将以非重叠模式将两个提示中的液体条纹沉积，并允许用户确认每个提示已发射。 在Cryo选项卡上，确保未选择Vitrify 网格，单击队列目标，然后点击Plunge。注：移液器阶段将略有上升，其次是网格阶段。然后，网格机器人将网格从发射分配器和上下摄像机上跳过，在甲板上方休息。上部摄像机的图像捕获显示在 UI 左侧下部摄像头的图像捕获上方。 评估上下图像：选择每个提示是否开火？当一起发射时，两个尖端的液体是否完全重叠，形成明显较厚的条纹，而不是单独发射时？ 如果尖端无法开火，则执行一个或多个超声波洗涤周期，直到观察到清晰的射击。 如果样品条纹没有完全重叠，则使用 Allen 键调整其中一个分配器的横向对齐，将一个分配器上的横向调整螺丝打开一个四分之一转，并执行测试跳动。重复，直到条纹完全重叠。注意：如果两个提示发射成功并如预期的那样，系统已准备好准备示例网格。 2. 准备双样本混合网格 更新 机器参数 XML 文件中的加速度、减速和速度值，以达到感兴趣的混合时间。注：将这些值与混合时间关联的表以前已报告15。 准备好样品和网格。注：从协议的这一点开始，在第一个网格准备之前，20-30 分钟将过去，在此时间间隔内，样品应保持在适当的温度。 将两个样本（即蛋白质和配体或其他相互作用的伙伴）稀释到所需的浓度上，并具有适当的缓冲，理想情况下，两者相同。注：Spotiton网格需要比通常用于自动跳冰柜的蛋白质浓度高1.5-2倍。这可能是由于蛋白质在跳槽时在网格表面的薄水层中花费的时间最少，使颗粒在空气-水接口集中的机会减少。 用液氮填充低温碗。 等离子清洁 3-4 纳米线网格。使用5W，氢和氧，1.5分钟作为起点。注：最有效的等离子清洁持续时间和配方可能会根据环境温度和湿度以及使用的纳米线网格的批次而改变。替代气体混合物或发光放电器也可能有效，但尚未为此目的进行测试。由于缓冲液中的水和蛋白质通常以不同速度被纳米线恶搞，因此最好在分配实际样品的暴跌中评估当天使用的网格的恶恶。 设置系统中的湿度水平。注：除了用于制作和等离子清洁网格的条件外，湿度是影响纳米线网格的回烁速度的另一个主要因素。虽然特定会话的目标百分比湿度是根据每天和一批网格的经验确定的，但 90-95% 是一个很好的起点。 确保雾化器充满超纯水。插入雾化器，观察雾化器盖上的中央端口的蒸汽出口。 观察主窗口的实时湿度监测器，或打开报告下的环境湿度跟踪器 |环境 （图 S4）。检查两个区域的湿度水平： 室 和 罩。注： 会议厅 包括斯波蒂顿外壳内的所有区域。 护罩 是立即包含网格和分配器提示的”相机”位置的区域。当外壳门打开以加载网格时，黑色树脂罩会保持设置的湿度水平。 达到目标湿度值后，从 湿度 选项卡自动或手动维护这些值。选择 自动控制，并选择一个设置点和阈值，以保持设置点在阈值限制内选择。或者，选择 手动控制，并调整湿度水平使用两个风扇控制： 室风扇 和 罩风扇。注意：打开室内风扇会通过左端口的过滤器拉出蒸汽，防止较大的水滴进入腔室，防止环境湿度进一步增加。只要室门保持关闭状态，湿度水平将稳定在预期百分比。打开护罩风扇将蒸汽通过右端口拉入罩中。这既减少了蒸汽释放到室内，又增加了罩内的湿度水平。 将样品加载到分配器中。 将每个样品的 5 μL 加入样品杯中。注意：为了避免引入气泡，将音量非常小心地分配到杯子的内侧壁上，然后摇动下来，将样品强制到杯子底部。 将样品杯加载到托盘中，取样器为左侧提示 1，右侧为提示 2。将托盘推回机器，直到其就座。 在 吸气 选项卡上，选择 3 μL，以便每个提示都吸气体积。确保样品托盘已安全就位，然后单击 Aspirate 并观察移液器阶段如何将分配器头移入样品杯中。 通过取出样品杯并观察液体水平下降来验证两个样品的成功愿望。 在 检查 选项卡上，将每个提示发送到检查摄像机以确认畅通无阻的配药。根据需要调整振幅，以匹配每个尖端的滴状（参见第 1.2 节）。注意：对于分配蛋白质样本的尖端，可能需要增加振幅。 系统现已准备好准备示例网格。 冻结示例网格 将新鲜等离子清洁的网格加载到钳子中，但尚未安装钳子。确保湿度水平升高，+90-95%。装满乙烷杯。 在检查摄像头前对两个尖端进行最后的试射，确认没有阻碍。在 Cryo 选项卡上，单击 “提示”到相机。 装满乙烷杯。如果乙烷冰形成，根据需要用额外的乙烷气体融化。注：步骤 2.5.4 和 2.5.5 应相对较快地完成（<20s），以最大限度地减少 （i） 纳米线在室内高湿度下饱和度，（ii） 尖端发射蛋白质样品堵塞的可能性。 将带网格的钳子安装到网格舞台上。在 Cryo 选项卡上，单击 网格到相机。确保提示 1 正确定位在上部摄像机监视器中（参见步骤 1.3.4-1.3.5）。 点击 Vitrify网格， 队列目标，然后 普朗格。当提示命令网格机器人将网格从乙烷跳入液氮并释放到水下搁板上时，单击 “确定 “。注：钳子然后上升回房间。跳到液氮后，会出现提示，询问网格是否从钳子上掉落。如果它没有下降，点击 否，钳子将打开和关闭几次，以分离网格。 检查网格图像（图S5），以决定是应保留还是丢弃。 如果保留网格，则将其转移到预冷却网格盒。或者，发现后续网格，然后立即将所有网格传输到网格框，注意每个网格可以由其在休息区域的位置进行识别。 要将网格传输到网格盒，请预先冷却细尖钳，轻轻抓住边缘的网格，并将其放入网格框插槽中，从槽左侧的第一个插槽顺时针开始。 当所有网格加载时，将网格盒盖连接到盖具上，并在液氮中预热。将盖子拧到网格盒上，然后用盖子工具或预制螺丝刀拧紧。 使用大钳子将封闭的网格盒快速转移到小型除战中进行成像或长期存储。 评估下游 EM 成像的网格适宜性。 观察在网格跳入后立即显示在 UI 左侧的上下俯冲路径摄像机的图像。使用这些图像来评估恶速、两个尖端的成功发射以及两个样品条纹的重叠程度。 使用实验查看器查看器查看上下摄像机的网格图像以及机器设置和湿度测量： 报告|实验。 选择电子显微镜中的成像网格，以证明良好的恶芯证据。