إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton
Summary
يصف البروتوكول المعروض هنا استخدام Spotiton ، وهو نظام روبوتي جديد ، لتقديم عينتين من الاهتمام على شبكة نانوية ذاتية الفتل تختلط لمدة لا تقل عن 90 مللي ثانية قبل التزجيج في cryogen السائل.
Abstract
لا يزال التقاط الحالات الجزيئية قصيرة الأجل الناجم عن اللقاء المبكر لاثنين أو أكثر من الجسيمات المتفاعلة يشكل تحديا تجريبيا ذا أهمية كبيرة في مجال المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM). وقد تم وضع عدد قليل من الاستراتيجيات المنهجية التي تدعم هذه الدراسات “حل الوقت”، واحدة منها، Spotiton-a نظام الروبوتية الجديدة يجمع بين الاستغناء عن قطرات عينة الحجم picoliter مع التحكم الزمني والمكاني الدقيق. يوفر سير عمل Spotiton الذي تم حله زمنيا نهجا فعالا بشكل فريد لاستجواب عمليات إعادة الترتيب الهيكلي المبكرة من الحد الأدنى لحجم العينة. أطلقت من موزعات كهربائية بيزوئية تسيطر عليها بشكل مستقل، وعينتين الأرض ومزيج بسرعة على شبكة EM nanowire لأنها تغرق نحو cryogen. يمكن إعداد مئات الشبكات في تعاقب سريع من عدد قليل من microliters فقط من عينة. هنا، يتم تقديم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتشغيل نظام Spotiton مع التركيز على استكشاف الأخطاء وإصلاحها مشاكل محددة تنشأ أثناء إعداد الشبكة.
Introduction
وقد تحققت إمكانية ل CRYO-EM لالتقاط وتكشف عن حالات تشكيلية عابرة من البروتينات على مقياس زمني دون الثاني (وقت حل cryo-EM) من قبل عدة مجموعات، بدءا من بريمان وأونوين1 الذي بنيت تقنية على طريقة تجميد الهبوط القياسية التي وضعتها دوبوشيه لإعداد شبكات التبريد EM2. وأضافوا رذاذ فقط فوق كوب cryogen التي تستخدم غاز النيتروجين المضغوط لرش ضباب غرامة من عينة ثانية على شبكة EM يغرق تحتوي على العينة الأولى التي تم تطبيقها ولطخت إلى طبقة مائي رقيقة. على الرغم من أن هذا النظام يمكن أن يحقق خلط مرات منخفضة تصل إلى 1 مللي ثانية ، فإنه لا يزال يتطلب النشاف اليدوي للعينة الأولى من قبل المستخدم – مهمة صعبة من الناحية الفنية ، وحجم مرتفع نسبيا من العينة الثانية. وعلاوة على ذلك، من الصعب عمليا معرفة مكان حدوث خلط العينتين، مما يتطلب استخدام الجسيمات النانوية الفيريتين كعلامة في العينة المختلطة. الجهود اللاحقة التي بذلها هوارد وايت وزملاء العمل تحسين السيطرة وإعادة إنتاج هذا النهج الرش خلط من خلال دمج التحكم في الكمبيوتر من النشاف والرش الخطوات3،4. لمعالجة مدى و أين تختلط العينات، انتقلت نفس المجموعة5 و غيرها6و7و8و9و10 إلى نهج خلط الرش11 حيث يتم خلط عينتين إما في أنابيب شعرية ضيقة تحت ضغط مضخات الحقن أو في رقائق ميكروفلويديك المصنعة الدقيقة التي يقودها غاز النيتروجين. هذه النظم premixing ليس فقط ضمان الاختلاط الكامل ، ولكن أيضا تمكين صقل أوقات الاختلاط لزيادة دقة الدراسات التي تم حلها في الوقت المناسب.
إدخال موزعات الكهروضوئية كوسيلة بديلة لتطبيق عينة على شبكات EM في نظام Spotiton مكنت كل من الاستهداف الدقيق لترسب العينة ومتطلبات حجم عينة أصغر بكثير لجعل الشبكة12. في وقت لاحق ، واستخدام شبكات nanowire وتطبيق عينة في الطريق (“على الطاير” اكتشاف) إزالة الحاجة إلى خطوة النشاف وخفض التطبيق إلى التزجيج مرات13،14. لنهج جديد لحل الوقت cryo-EM وصفها هنا، تم إضافة موزع الثاني جنبا إلى جنب مع أجهزة التحكم اللازمة وترقيات البرمجيات إلى نظام Spotiton لتمكين تسليم عينة ثانية على شبكة nanowire تتحرك على الفور تقريبا بعد ترسب أول15. مزيج اثنين من عينات متداخلة على الشبكة لأنها شريرة من قبل nanowires في طبقة مائي رقيقة قبل التزجيج. يمكن تحقيق خلط مرات منخفضة مثل 90 مللي ثانية. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير معلومات عملية حول كيفية إجراء التجارب التي تم حلها زمنيا باستخدام الاستغناء الكهربائي والشبكات النانوية. بالإضافة إلى ذلك، كما يتم تعديل الأجهزة والبرامج لتحسين سهولة الاستخدام والتناسق والإنتاجية، هذا البروتوكول أيضا بمثابة وصف محدثة من الأسلوب15المبلغ عنها سابقا .
Protocol
Representative Results
Discussion
يحدد هذا البروتوكول استخدام نظام Spotiton الروبوتي لإعداد شبكات التصوير بالتبريد -EM التي تحمل عينتين ، عادة بروتين مثير للاهتمام وليغاند نشط ، تم خلطهما لمدة 90-500 مللي ثانية. على الرغم من أن سير العمل مباشر، إلا أن هناك بعض الاعتبارات التي يجب على المستخدم وضعها في الاعتبار لضمان جلسة عمل إنتاجية لصنع الشبكة. أولا، ليس من غير المألوف أن تصبح إحدى نصائح موزع الكهروضوئي مسدودة أو مسدودة تمنعها من إطلاق النار. سيؤدي مثل هذا الفشل إلى شريط سائل ، يظهر على التقاط الصور من الكاميرا العلوية أو السفلية ، وهو أضيق بشكل واضح من ذلك الذي شوهد بعد إطلاق كلتا النصائح. يمكن أن ينتج الانسداد عن فقاعة هوائية في الطرف ، مما يعطل تكوين القطيرات ، أو من عينة البروتين التي جفت وأغلقت فتحة الطرف الضيقة. على الرغم من فقدان العينة يستنشق في هذه العملية، يمكن حل كل من المشاكل عن طريق غسل بالموجات فوق الصوتية من النصائح وإعادة الطموح للعينة. لمنع انسداد اللاحقة وعينة النفايات، فمن الأهمية بمكان لرئيس تماما (دافق) خطوط السوائل قبل الطموح عينة والحفاظ على مستوى الرطوبة عالية ومتسقة داخل الغرفة والكفن. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر عينة البروتين ذات التركيز العالي بشكل خاص على إطلاق البقشيش على الرغم من الرطوبة التي يتم الحفاظ عليها بشكل جيد. على الرغم من أن زيادة سعة الإطلاق على علامة التبويب Inspect يمكن أن تعوض جزئيا عن ضعف إطلاق النار بسبب تركيز البروتين العالي ، فإن تمييع العينة على الأقل 1:2 سيحسن إطلاق البقشيش وتجنب الانسداد.
ثانيا، قد يكون من الصعب تحقيق سرعة الفتل المثالية اللازمة لتوليد جليد من سمك أمثل لمدة الخلط المستهدفة. عموما، سوف أوقات خلط أسرع تتطلب فتل أسرع، وأوقات خلط أبطأ تتطلب فتل أبطأ. بالنسبة للشبكة الشريرة بشكل مثالي ، يمكن تمييز الشريط السائل بوضوح في صورة الكاميرا العلوية ، بينما في الكاميرا السفلية ، لا يزال سماكة طفيفة جدا لقضبان الشبكة في موقع الشريط مرئية. فتل بطيء، وأشار من قبل شريط داكن على صورة الكاميرا السفلى، ويترك عموما الجليد التي هي سميكة جدا للتصوير. غياب شريط على أي صورة يشير إلى فتل سريع التي قد تركت أي ماء في الثقوب (الشكل S5). يمكن أن تؤثر عدة عوامل مثل كثافة الأسلاك النانوية وإعدادات تنظيف البلازما ومدتها ووقت التعرض لمستوى رطوبة الغرفة وتعيينه على سرعة الفتل. قد يكون فتل الفقراء (البطيء) نتيجة لطلاء متناثر من الأسلاك النانوية على الشبكة. عن طريق تخفيف قليلا وزيادة وقت التعرض للحل nanowire16، وكثافة وتغطية nanowires على قضبان الشبكة وزيادة ، وتسهيل أسرع فتل. إذا كانت كثافة الأسلاك النانوية كافية ، فإن زيادة إعداد القوة الكهربائية أو مدة تنظيف البلازما ستحسن أيضا الفتل. الإعدادات الموصى بها هنا منخفضة نسبيا ومدة طويلة، ولكن قد تتغير إذا لزم الأمر.
ومع ذلك ، إذا كانت كل من الدفعة المحددة من الشبكات وإعدادات تنظيف البلازما قد عملت بشكل جيد في جلسة سابقة ، فقد ينشأ أداء الفتل البطيء من التعرض المفرط للأسلاك النانوية إلى رطوبة عالية داخل الغرفة ، مما يؤدي إلى تشبعها بالرطوبة وتقليل القدرة على حمل السائل. يمكن تقليل تأثير تشبع الشبكة من رطوبة الغرفة إما عن طريق تقليل الوقت المنقضي بين تصاعد ملاقط والشبكة تغرق أو خفض مستوى رطوبة النظام قبل الهبوط. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذا الأخير يجلب الخطر المرتبط بأن الطرف المحملة عينة البروتين سوف تسد. لتعويض هذا الخطر، عقد نصائح في الكفن حيث يتم الحفاظ على مستوى الرطوبة العالية، يمكن أن تزيد من مقدار الوقت المسموح به لتركيب ملاقط عقد شبكة جديدة. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن انخفاض وقت الهبوط (الذي يتحقق عن طريق زيادة تسارع الشبكة و / أو السرعة القصوى) يمكن أن يؤدي إلى شبكات مع الجليد أرق دون تغيير خصائص الفتيل في الواقع من الشبكة. ومع ذلك ، كما سيتم أيضا تقليل وقت خلط العينتين ، فإن وقت الهبوط ليس عاملا يتم تغييره عادة لمعالجة الفتل البطيء. لمعالجة الفتل الذي هو سريع جدا، مما أدى إلى الجليد التي هي إما رقيقة جدا أو غائبة في ثقوب الشبكة، يمكن اتخاذ عكس التدابير المبينة أعلاه.
Spotiton يقدم بعض المزايا والعيوب بالمقارنة مع التقنيات الأخرى التي وضعت للدراسات دون الثانوية حل الوقت. كما يحتوي على شريط عينة مختلطة فقط 2-4 nL من السائل من كل موزع، واحد 3 ميكرولتر aliquot من كل عينة كافية لإعداد العديد من الشبكات-ميزة رئيسية عندما تكون العينة محدودة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مراقبة ترسب العينة باستخدام الكاميرات المتكاملة ، على الرغم من أنها ليست فريدة تماما ل Spotiton17، ليست سمة من سمات أجهزة الخلط الأخرى وتسمح للشبكات المغرقة بالخضوع لتقييم تمرير / فشل الخام ، مما يقلل إلى حد كبير من وقت الفحص. أحد العيوب الرئيسية للنظام هو الحد الأدنى من وقت الاختلاط 90 مللي ثانية ، مقيدا بالقيود المادية للمكونات الميكانيكية ، مما يجعل استجواب التفاعلات البيولوجية الأسرع بعيدا عن متناول اليد. وعلى سبيل المقارنة، يتم تحقيق أقل من 10 مللي ثانية بشكل روتيني على الأنظمة الدقيقة الفلورية الموجودة. على Spotiton القائم على نظام الحرباء المتاحة تجاريا ، والتصميم والبناء التحسينات خفضت الحد الأدنى من الوقت يغرق إلى 54 مللي ثانية ، ورفع احتمال أن إضافة موزع الثاني يمكن أن تسمح أسرع أوقات الاختلاط من Spotiton يمكن أن تقدم حاليا.
حتى الآن ، تم إجراء مجموعة من التجارب للتحقيق في الحالات الجزيئية المبكرة قصيرة الأجل باستخدام Spotiton ، بما في ذلك تجميع الريبوسوم 70S ، والتغيرات التركيبية الناجمة عن الكالسيوم في قناة أيونات عبر الميمبران ، وانقباض ال دينامين استجابة للتحلل المائي GTP15. ومنذ نشر هذه النتائج، أدخلت عدة تغييرات على النظام لتعزيز إنتاجية دورات صنع الشبكة Spotiton وإعادة استنساخها والإبلاغ عنها. وتشمل هذه، من بين أمور أخرى، نظام مراقبة الرطوبة والتحكم التلقائي في المنطقة المزدوجة، وميزة عارض التجربة، وميزة فحص البقشيش جنبا إلى جنب، والعديد من الترقيات الطفيفة لواجهة المستخدم. وسيدعم النظام المطور بشكل أفضل تجارب الخلط المستقبلية ذات العينتين المماثلة لتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا وكذلك المقايسات الملزمة السريعة مثل بين علاج جزيء صغير وهدفه البروتيني أو حتى تكوين مركب مستضد الأجسام المضادة. وفي حين أن التجارب الحالية والمستقبلية التي تم حلها زمنيا والتي تشمل شريكين متفاعلين ستستمر بالتأكيد، فإن إضافة موزع كهرومغناطيس ثالث وما يرتبط به من أجهزة يمكن أن يزيد من توسيع نطاق التجارب المحتملة. على سبيل المثال، يمكن أن يزيل الترسب الأولي للمنظفات يليه البروتين المثير للاهتمام، يليه ليغاند المتفاعل أو المنشط أي تأثير سلبي محتمل للتعرض الموسع للمنظفات، وغالبا ما يكون ضروريا لمنع نتائج التصوير الشائعة دون المستوى الأمثل مثل التوجه المفضل. في ضوء كل من العمل المنشور بالفعل والتطبيقات المستقبلية المحتملة ، تمثل Spotiton أداة مهمة لمجتمع cryo-EM لتسهيل إجراء دراسات حل الوقت الثانوي.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر بيتر أ. كان وتيري رود في شركة الفنون الهندسية ذ.م.م (أريزونا، الولايات المتحدة الأمريكية) على التصميم الأولي والتطوير اللاحق لنظام Spotiton. نشكر موظفي مركز سيمونز للفحص المجهري الإلكتروني في مركز نيويورك للبيولوجيا الهيكلية على المساعدة والدعم التقني. تم تنفيذ العمل المعروض هنا في المورد الوطني للمجهر الجزيئي الآلي الموجود في مركز نيويورك للبيولوجيا الهيكلية، بدعم من المنح المقدمة من المعاهد القومية للصحة (GM103310) ومؤسسة سيمونز (SF349247).
Materials
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
Referenzen
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -. E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
- Wei, H., et al. Optimizing “self-wicking” nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
