3D-активация всего мозга и картирование функциональной связности у мышей с использованием транскраниальной функциональной ультразвуковой визуализации
Summary
Этот протокол описывает количественную оценку объемных церебральных гемодинамических вариаций в мозге мыши с использованием функционального ультразвука (fUS). Процедуры для 3D-карты функциональной активации после сенсорной стимуляции, а также функциональной связности состояния покоя приведены в качестве иллюстративных примеров у анестезирующих и бодрствующих мышей.
Abstract
Функциональная ультразвуковая визуализация (fUS) – это новый метод визуализации мозга, который опирается на высокочувствительную меру объема мозговой крови, достигаемую с помощью сверхбыстрой допплерографии. Поскольку перфузия мозга тесно связана с локальной нейронной активностью, этот метод позволяет 3D-картировать весь мозг региональной активации, вызванной задачей, а также функциональную связь в состоянии покоя, неинвазивно, с непревзойденным пространственно-временным разрешением и простотой работы. По сравнению с фМРТ (функциональная магнитно-резонансная томография), основное преимущество fUS-визуализации заключается в обеспечении полной совместимости с экспериментами на животных. Кроме того, картирование мозга фМРТ у мышей, наиболее используемая доклиническая модель в неврологии, остается технически сложной из-за небольшого размера мозга и трудности поддержания стабильных физиологических условий. Здесь мы представляем простой, надежный и надежный протокол для визуализации fUS всего мозга у анестезированных и бодрствующих мышей с использованием готовой коммерческой системы fUS с моторизованным линейным преобразователем, что дает значительную кортикальную активацию после сенсорной стимуляции, а также воспроизводимую 3D-функциональную схему подключения для идентификации сети.
Introduction
За последние два десятилетия нейровизуализация стала важным инструментом для изучения функции и организации мозга, что позволяет исследователям делать важные открытия в области нейробиологии. Сегодня функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ) стала золотым стандартом клинической нейровизуализации для оценки активации мозга, вызванной вызовом или лекарственными средствами, и для отображения функциональной связности в состоянии покоя. В то время как фМРТ человека обладает высокой надежностью и чувствительностью, фМРТ мыши остается технически сложной по многим причинам1. Во-первых, фМРТ имеет плохое пространственное и временное разрешение. Небольшой размер мозга мыши требует использования сильных магнитных полей с использованием дорогостоящих сканеров для достижения разумного пространственного разрешения. Во-вторых, поддержание стабильных физиологических параметров в узком диапазоне, позволяющем эффективную нейроваскулярную связь, очень сложно у анестезирующих мышей. Наконец, сигнал, зависящий от уровня кислорода в крови (BOLD), на который опираются исследования фМРТ, имеет относительно низкую чувствительность, что приводит к низкому соотношению сигнал/шум при применении к мышам и часто требует повторного представления стимула в течение длительного сбора для обнаружения небольших вариаций. Поскольку мышь является наиболее широко используемой моделью на животных в биомедицинских доклинических исследованиях, эти ограничения частично ответственны за трансляционный разрыв в нейропсихиатрии, препятствуя переносу новых перспективных терапевтических целей на стенде в эффективные методы лечения у постели.
Функциональное ультразвуковое исследование (fUS) – это недавно разработанная техника нейровизуализации, основанная на сверхбыстрой допплере2. Непосредственно отбирая объем мозговой крови, этот метод позволяет профилактически прощать активность мозга в режиме реального времени через нейрососудистую связь. По сравнению с другими методами нейровизуализации, fUS дает пространственное разрешение 100 мкм и временное разрешение в десятки миллисекунд. Этот метод позволяет визуализирование всего мозга полных коронарных участков мозга мыши, полностью неинвазивно. Кроме того, он полностью совместим с сознательными и веющими себя животными3,4,5. Одним из основных ограничений тока fUS является его 2D-функция, позволяющая одновременно записывать одну корональный плоскость. В то время как объемный 3D-fUS с использованием 2D-матрицы датчиков уже был успешно продемонстрирован на крысах6 и подтвержден на мышах7,его текущее отсутствие чувствительности требует полной треканиотомии, а также усреднения важного числа испытаний для обнаружения небольшого изменения активности. Альтернативно, линейные преобразователи могут быть шагнули через несколько положений и выполнять функциональную визуализацию плоскость за плоскостью, чтобы охватить весь мозг. Однако этот метод требует многочисленных экспериментальных повторений парадигм и как такового длительного времени приобретения (3-4 часа для мозга мыши)8,9.
В настоящей работе мы описываем надежную экспериментальную платформу, включавшую коммерчески доступный функциональный ультразвуковой сканер и линейный преобразователь с быстрым плоским переключением с процедурами получения 3D-данных fUS у анестезированных и бодрствующих мышей, что позволяет осуществлять объемное и транскраниальное функциональное картирование мозга мыши, неинвазивно, без контрастного агента и в течение короткого времени сбора. Мы иллюстрируем эту особенность, отображая активацию соматосенсорной коры после стимуляции усов, а также функциональную связность состояния покоя. Помимо подготовки животных и сбора данных, мы также описываем процедуру визуализации, регистрации атласа и анализа сигналов fUS в режиме реального времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы визуализации всего мозга являются важнейшими инструментами для лучшего понимания физиологии и патологии мозга. Метод, описанный здесь, позволяет точно количественно определять гемодинамические сигналы в живом мозге непосредственно на скамейке запасных. Непревзойденная чувствительность и пространственно-временное разрешение функционального ультразвука особенно хорошо подходят для физиологии мыши. Функциональные ответы и сети состояния покоя могут быть отображены в течение короткого времени сбора, продольно и без необходимости усреднять испытания или субъектов для получения надежной меры. Соответствующая комбинация высокочувствительных ультразвуковых линейных зондов и быстрых моторизованных установок позволяет выполнять транскраниальную объемную fUS-визуализацию на мышах в разумные сроки приобретения. Этот протокол может быть выполнен как на анестезированных, так и на бодрствующих мышах с использованием мобильной домашней клетки.
Стимуляция усов, сенсорный стимул, используемый в качестве иллюстраторного примера в этой рукописи, является стандартной парадигмой функциональной активации у грызунов и надежным считыванием для изучения сенсорной обработки, нейрососудистой связи и их изменений5,6,10,11. В то время как грубая ручная чистка усов может быть предпочтительной из-за простоты использования, этому методу не хватает пространственной и временной точности. Использование автоматического стимулятора, такого как описанный здесь, запускаемый сканером изображения fUS, позволяет лучше контролировать несколько параметров, включая время начала, смещение амплитуды, частоту, а также угол Q-наконечника / гребня, что приводит к лучшей воспроизводимости между животными. Кроме того, более точное время стимуляции позволяет моделировать функцию гемодинамического ответа (HRF) путем определения времени до начала и времени до пиковых параметров12,13. Чтобы обеспечить лучшую точность количества усов, отклоненных во время стимуляции (и, следовательно, области активированной области), более сложные стимуляторы могут быть адаптированы к этому протоколу. Многие другие стимулы, такие как свет8,звук14 или представление запаха15, могут быть реализованы с использованием того же протокола.
Совместимость функционального ультразвука с бодрствующими и веющими себя животными является важным преимуществом по сравнению с другими методами нейровизуализации, позволяющими картировать функциональную активацию без смещения анестезии. Использование мобильной домашней колясы с воздушным подъемом является хорошей альтернативой другим существующим головным аппаратам, таким как линейные или сферические беговые дорожки. Будучи прочно зафиксированным головой, движение домашней камеры дает мыши иллюзию навигации по окружающей среде, позволяя сочетать широкий спектр поведенческих тестов с изображениями fUS16. Тем не менее, процедура привыкания к фиксации головы представляет собой важный шаг для снижения стресса, особенно для экспериментов, где его можно считать мешающим фактором. Процедура, описанная здесь (6-дневная обработка и привыкание к фиксации головы), дает надежные результаты для сенсорной стимуляции и функциональной связности состояния покоя. Тем не менее, возможно, потребуется продлить период привыкания для более совершенных поведенческих тестов17.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Расширенным грантом Европейского исследовательского совета (ERC) No 339244-FUSIMAGINE, Национальным агентством по финансированию исследований «Pinch» (ANR-18-CE37-005), Ускорителем исследовательских технологий Inserm в биомедицинском ультразвуке, техническим ядром ElfUS IPNP, Inserm U1266, европейской исследовательской программой FUSIMICE проекта «Человеческий мозг» и краткосрочной стипендией EMBO 8439 андреа Кливер.
Materials
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
Referenzen
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. Functional ultrasound imaging of the brain. Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
