3D-Aktivierung des gesamten Gehirns und funktionelle Konnektivitätskartierung bei Mäusen mit transkranieller funktioneller Ultraschallbildgebung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung volumetrischer zerebraler hämodynamischer Variationen im Mausgehirn mittels funktionellem Ultraschall (fUS). Verfahren für eine funktionelle 3D-Aktivierungskarte nach sensorischer Stimulation sowie funktionelle Konnektivität im Ruhezustand werden als illustrative Beispiele bei anästhesierten und wachen Mäusen bereitgestellt.
Abstract
Die funktionelle Ultraschallbildgebung (fUS) ist eine neuartige Bildgebungsmodalität des Gehirns, die auf der hochempfindlichen Messung des zerebralen Blutvolumens beruht, die durch ultraschnelle Doppler-Angiographie erreicht wird. Da die Hirnperfusion stark mit der lokalen neuronalen Aktivität verbunden ist, ermöglicht diese Technik die 3D-Kartierung der aufgabeninduzierten regionalen Aktivierung sowie der funktionellen Konnektivität im Ruhezustand, nicht-invasiv, mit unübertroffener räumlich-zeitlicher Auflösung und operativer Einfachheit. Im Vergleich zur fMRT (funktionelle Magnetresonanztomographie) besteht ein Hauptvorteil der fUS-Bildgebung darin, eine vollständige Kompatibilität mit Wach- und Verhaltenstierversuchen zu ermöglichen. Darüber hinaus bleibt die fMRT-Gehirnkartierung bei Mäusen, dem am häufigsten verwendeten präklinischen Modell in den Neurowissenschaften, aufgrund der geringen Größe des Gehirns und der Schwierigkeit, stabile physiologische Bedingungen aufrechtzuerhalten, technisch schwierig. Hier präsentieren wir ein einfaches, zuverlässiges und robustes Protokoll für die Ganzhirn-fUS-Bildgebung bei anästhesierten und wachen Mäusen unter Verwendung eines handelsüblichen kommerziellen fUS-Systems mit einem motorisierten linearen Wandler, das eine signifikante kortikale Aktivierung nach sensorischer Stimulation sowie ein reproduzierbares 3D-Funktionskonnektivitätsmuster zur Netzwerkidentifikation liefert.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich das Neuroimaging zu einem wichtigen Werkzeug für die Untersuchung der Gehirnfunktion und -organisation entwickelt, das es Forschern ermöglicht, wichtige Entdeckungen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften zu machen. Heute ist die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) zum Goldstandard der klinischen Neuroimaging-Technik geworden, um die Aktivierung des Gehirns zu beurteilen und die funktionelle Konnektivität in Ruhe abzubilden. Während die menschliche fMRT eine hohe Zuverlässigkeit und Sensibilität aufweist, bleibt die fMRT der Maus aus zahlreichen Gründen technisch anspruchsvoll1. Erstens hat fMRT eine schlechte räumliche und zeitliche Auflösung. Die geringe Größe des Mausgehirns erfordert die Verwendung starker Magnetfelder mit teuren Scannern, um eine vernünftige räumliche Auflösung zu erreichen. Zweitens ist es bei anästhesierten Mäusen sehr schwierig, stabile physiologische Parameter innerhalb des engen Bereichs aufrechtzuerhalten, die eine effiziente neurovaskuläre Kopplung ermöglichen. Schließlich hat das BOLD-Signal (Blood Oxygen Level Dependent), auf das sich fMRT-Studien stützen, eine relativ schlechte Empfindlichkeit, was zu einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis führt, wenn es auf Mäuse angewendet wird, und erfordert oft eine wiederholte Reizpräsentation über lange Erfassungen, um kleine Variationen zu erkennen. Da die Maus das am weitesten verbreitete Tiermodell in der biomedizinischen präklinischen Forschung ist, sind diese Einschränkungen teilweise für die Translationslücke in der Neuropsychiatrie verantwortlich und behindern neue vielversprechende therapeutische Ziele auf der Bank, die in wirksame Behandlungen am Krankenbett umgesetzt werden können.
Funktioneller Ultraschall (fUS) ist eine kürzlich entwickelte Neuroimaging-Technik, die auf ultraschnellem Doppler2basiert. Durch die direkte Entnahme des zerebralen Blutvolumens ermöglicht diese Technik die Untersuchung der Gehirnaktivität in Echtzeit durch die neurovaskuläre Kopplung. Im Vergleich zu anderen Neuroimaging-Techniken liefert fUS eine räumliche Auflösung von 100 μm und eine zeitliche Auflösung im zweistelligen Millisekundenbereich. Diese Technik ermöglicht die Bildgebung des gesamten Gehirns von vollständigen koronalen Abschnitten des Mausgehirns, vollständig nicht-invasiv. Darüber hinaus ist es voll kompatibel mit bewussten und sich verhaltenden Tieren3,4,5. Eine der wichtigsten aktuellen Einschränkungen von fUS ist seine 2D-Funktion, die es ermöglicht, eine einzelne koronale Ebene gleichzeitig aufzunehmen. Während volumetrische 3D-fUS unter Verwendung von 2D-Matrix-Array-Aufnehmern bereits erfolgreich bei Ratten6 nachgewiesen und bei Mäusen7bestätigt wurden, erfordert ihr derzeitiger Mangel an Empfindlichkeit eine vollständige Kraniotomie sowie die durchschnittliche Anzahl von Studien, um eine leichte Änderung der Aktivität zu erkennen. Alternativ können lineare Wandler über mehrere Positionen gestuft werden und funktionelle Bildgebungsebene für Ebene durchführen, um das gesamte Gehirn abzudecken. Diese Technik erfordert jedoch zahlreiche experimentelle Paradigmenwiederholungen und damit lange Erfassungszeiten (3-4 Stunden für das Mausgehirn)8,9.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir eine robuste experimentelle Plattform mit einem kommerziell erhältlichen funktionellen Ultraschallgerät und einem schnellen linearen Wandler mit Methoden zur Erfassung von 3D-fUS-Daten in anästhesierten und wachen Mäusen, die eine volumetrische und transkranielle funktionelle Kartierung des Mausgehirns ermöglichen, nicht-invasiv, ohne Kontrastmittel und innerhalb kurzer Erfassungszeiten. Wir veranschaulichen diese Eigenschaft, indem wir die Aktivierung des somatosensorischen Kortex nach whisker Stimulation sowie die funktionelle Konnektivität im Ruhezustand kartieren. Neben der Tieraufbereitung und Datenerfassung beschreiben wir auch das Verfahren zur Visualisierung, Atlasregistrierung und Analyse von Echtzeit-fUS-Signalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bildgebende Verfahren des gesamten Gehirns sind entscheidende Werkzeuge, um die Physiologie und Pathologie des Gehirns besser zu verstehen. Die hier beschriebene Methode erlaubt die präzise Quantifizierung hämodynamischer Signale im lebenden Gehirn direkt an der Bank. Die unübertroffene Sensitivität und räumlich-zeitliche Auflösung des funktionellen Ultraschalls eignet sich besonders gut für die Mausphysiologie. Funktionelle Reaktionen und Ruhezustandsnetzwerke können innerhalb kurzer Erfassungszeiten longitudinal und ohne durchschnittliche Studien oder Probanden abgebildet werden, um ein zuverlässiges Maß zu erhalten. Die relevante Kombination aus hochempfindlichen linearen Ultraschallsonden und schnellen motorisierten Setups ermöglicht es, transkranielle volumetrische fUS-Bildgebung bei Mäusen innerhalb angemessener Erfassungszeiten durchzuführen. Dieses Protokoll kann entweder an betäubten oder wachen Mäusen mit einem Wohnmobilkäfig durchgeführt werden.
Die Whisker-Stimulation, der sensorische Reiz, der in diesem Manuskript als veranschaulichendes Beispiel verwendet wird, ist ein Standard-Paradigma der funktionellen Aktivierung bei Nagetieren und ein zuverlässiges Auslesen, um die sensorische Verarbeitung, die neurovaskuläre Kopplung und ihre Veränderungen zu untersuchen5,6,10,11. Während das grobe manuelle Bürsten der Schnurrhaare wegen seiner Benutzerfreundlichkeit bevorzugt werden kann, fehlt es dieser Methode an räumlicher und zeitlicher Präzision. Die Verwendung eines automatischen Stimulators, wie er hier mit dem fUS-Bildgebungsscanner ausgelöst wird, ermöglicht eine bessere Kontrolle mehrerer Parameter, einschließlich des Zeitpunkts des Auftretens, der Amplitudenverschiebung, der Frequenz sowie des Winkels der Q-Spitze / des Kamms, was zu einer besseren Reproduzierbarkeit zwischen den Tieren führt. Darüber hinaus ermöglicht ein präziseres Timing der Stimulation die Modellierung der hämodynamischen Reaktionsfunktion (HRF) durch Bestimmung der Zeit bis zum Einsetzen und der Zeit bis zum Peak der Parameter12,13. Um eine bessere Präzision bei der Anzahl der während der Stimulation abgelenkten Schnurrhaare (und damit des Bereichs der aktivierten Region) zu gewährleisten, können ausgefeiltere Stimulatoren an dieses Protokoll angepasst werden. Viele andere Reize wie Licht8,Ton14 oder Geruchsdarstellung15 können mit dem gleichen Protokoll umgesetzt werden.
Die Kompatibilität von funktionellem Ultraschall mit wachen und sich verhaltenden Tieren ist ein wichtiger Vorteil im Vergleich zu anderen Neuroimaging-Techniken, der eine funktionelle Aktivierungskartierung ohne anästhesieverzerrung ermöglicht. Die Verwendung eines luftgestützten mobilen Heimkäfigs ist eine gute Alternative zu anderen bestehenden kopffesten Geräten wie linearen oder sphärischen Laufbändern. Während die Bewegung des Homecage fest am Kopf fixiert ist, gibt sie der Maus die Illusion, durch die Umgebung zu navigieren, so dass eine breite Palette von Verhaltenstests an die fUS-Bildgebung16gekoppelt werden kann. Das Gewöhnungsverfahren zur Kopffixierung stellt jedoch einen wichtigen Schritt zur Verringerung von Stress dar, insbesondere für Experimente, bei denen es als Störfaktor angesehen werden kann. Das hier beschriebene Verfahren (6 Tage Handhabung und Gewöhnung an die Kopffixierung) liefert robuste Ergebnisse für die sensorische Stimulation und die funktionelle Konnektivität im Ruhezustand. Es könnte jedoch notwendig sein, die Gewöhnungszeit für verfeinerte Verhaltenstests zu verlängern17.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE des Europäischen Forschungsrats (ERC), die Nationale Forschungsagentur zur Finanzierung von “Pinch” (ANR-18-CE37-005), den Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, den elfus technischen Kern des IPNP, Inserm U1266, das europäische Forschungsprogramm FUSIMICE des Human Brain Project und embo Short-Term Fellowship 8439 an Andrea Kliewer.
Materials
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
Referenzen
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