使用经颅功能超声成像的小鼠全脑3D激活和功能连接映射

此处提出的所有程序均按照2010年9月22日的欧洲共同体理事会指令（010/63/UE）和我们的地方道德委员会（第59号”巴黎中心和南部”，项目#2017-23）执行。成年小鼠（雄性C57BL / 6 Rj，年龄2-3个月，20-30g，来自法国Janvier Labs）每个笼子饲养4只，具有12小时的光/暗循环，恒温在22°C，食物和水随意。在实验开始之前，动物被给予一周的最低适应期，以适应住房条件。 1. 用于麻醉fUS成像的动物制剂 麻醉 称量鼠标。 在无菌盐水中分别以10mg / mL和2mg / mL制备氯胺酮和西噻嗪的混合物。使用 26 号针头和 1 mL 一次性注射器腹膜内给药 0.2 mL 氯胺酮/木肼嗪溶液。几分钟后，将动物放在立体塔架上，确保头部是平的。 给予第二体积的麻醉剂，以达到100mg / kg氯胺酮和20mg / kg木拉嗪的总剂量（考虑到初始剂量）。注意：麻醉应持续1小时。为了长时间保持稳定的镇静，腹膜内每30分钟注射0.05mL氯胺酮/木肼嗪混合物。 麻醉成像的动物准备 在小鼠眼睛上涂抹一些眼药膏（例如，Ocry-Gel），以避免在成像过程中形成任何白内障。使用修剪器剃须鼠标头。涂抹一些脱毛霜，几分钟后冲洗干净。重复此步骤，直到头发完全脱落。 在四肢中插入皮下插针以进行心电图（ECG）记录。将离心超声凝胶（1500转/分，5分钟）放在头上。 在整个实验期间监测麻醉深度（包括麻醉诱导）。通过使用与直肠探头耦合的加热毯将动物的温度保持在37°C。 监测以下生理参数，这些参数是麻醉深度的间接指标：心率（每分钟220-250次 – 通过皮下植入的心电图薄电极监测）和呼吸频率（每分钟130-140次呼吸 – 使用连接到ECG采集系统的肺活量计监测）。注：实验设置的说明如图 1所示。 图1：麻醉fUS实验的实验设置。实验设置的描述显示了麻醉实验期间所需的所有科学设备。1.生理监测：实时显示呼吸和心脏频率。2.由Iconeus One系统（9）监测的四轴电机模块（三平移和一次旋转），并允许执行经颅3D断层扫描或4D采集。3a.伺服电机驱动晶须刺激器（3b.）伺服电机由arduino uno卡控制，该卡与Iconeus One系统（9）连接，以便将刺激模式与成像序列同步。4.a.注射泵控制器。4.b.注射器支架。5.a.温度板监视器控制加热板。5.b.加热板和直肠温度计与温度板监视器（5.a.）连接。6.超声凝胶放置在动物头部和超声探头之间，提供它们之间的声耦合。7. 15 MHz超声探头。8.探头支架将探头（7）连接到电机模块（2）。9. Iconeus 一个设备和软件，允许对不同的成像序列进行编程并控制驱动探头的电机模块（2个）（7个）。请点击此处查看此图的放大版本。 2. 清醒头固定小鼠实验的动物准备 头板手术 将麻醉的动物（步骤1.1-1.2）放在加热垫（37°C）的立体定位架中。将保护凝胶涂抹在眼睛上，并使用26号针头在头皮皮肤下施用利多卡因s.c（0.2 mL，2%），并等待几分钟。注意：每10-30分钟监测一次麻醉水平，通过对牢固的脚趾捏合的反应（没有）。 在矢状缝合线后从枕骨后面到鼻骨的起点做一个切口。使用手术剪刀切除两个半球的皮肤。 用1%碘溶液清洁颅骨，并去除任何剩余的骨膜。使用头板作为模板，在颅骨上钻两个孔（直径1毫米）以定位锚固螺钉。注意：注意不要完全钻穿颅骨，以避免任何脑损伤或硬脑膜炎症 用螺钉定位头板。使用牙科水泥将螺钉和头板固定在框架的前面和后面，以保持植入物的良好抓地力。注意：注意不要在框架窗口内涂水泥，因为这会大大降低信号质量。用一层薄薄的手术胶水覆盖颅骨，以保护骨骼并密封成像窗口侧面的伤口。 在水泥干燥后，将动物从立体定位架上取出，并通过皮下注射阿替帕唑（1mg / kg）逆转麻醉。针对术后疼痛，预防性给予美洛昔康（5 mg/kg/天，s.c）。 将动物放在加热垫（37°C）上的恢复笼中。老鼠可以在几个小时内带着幼崽回到家笼子里。在头板上放置一个磁性3D打印的盖子（带有磁铁嵌件的聚己酸材料）以进行保护（图2A）。在开始适应移动房屋笼子（MHC）之前，让鼠标恢复4至6天。注：瓶盖和顶板的总重量为2.8克。 处理和习惯 在恢复后（PR）的第1天，轻轻地将鼠标握在手中5-10分钟，每天几次。 在第2天PR中，重复处理，如第1天一样，让动物自由探索MHC5-10分钟。注意：在房间里播放一些背景音乐可以帮助减轻动物的压力。 在第3天的PR中，让动物自由探索MHC5-10分钟。之后，小心地抓住头板并将其轻轻地放在夹具中，手动移动碳笼以陪伴鼠标。将动物固定在头部固定位置5-10分钟。在训练课之间用70%乙醇溶液清洁MHC，并用自来水冲洗。注意：确保 MHC 按照制造商的建议接收到足够的气流。头部夹的高度需要手动调整，以提供舒适的位置。 在第4天和第5天PR中，反复夹住小鼠MHC并逐渐增加头部固定时间，从5分钟开始，直到30分钟。在成像窗口上涂抹一些生理盐水和超声凝胶以习惯。 在第6天PR，重复第4/5天PR的实验方案，并按照步骤3.1将探针放置在动物头部上方。 在实验当天，如上所述进行。然后，用生理盐水加湿成像窗口并应用一些超声凝胶。开始跟踪动物并继续探头定位（见下文）。注意：MHC中的夹紧也可以通过将鼠标包裹在抹布中来完成。在这种情况下，小鼠在头部固定之前需要习惯于包裹程序。 图2B提供了用于清醒成像的完整实验设置的描述。 图2：清醒fUS实验的实验设置。一个。 保护成像窗口的头板磁性盖的示意图（使用 BioRender.com 创建）。在成像过程中（左），盖子被取下，以在头板提供的大孔中扫描大脑。 二. 头部固定自由行为小鼠经颅清醒成像实验装置的照片。 1. Iconeus One系统和软件，允许设置不同的成像序列并控制电机模块。 2. 四轴电机模块（三平移和一转）由Iconeus One系统（1）监控，并允许3D断层扫描或4D采集。 3. 空气分配台。 4. 移动房屋笼（MHC）。 5a，5b. 照片显示了MHC内动物环境的近距离视图。 6. 头部固定系统夹紧头板。 7. 探头支架将探头与电机模块（2）连接起来。 8. 15 MHz超声波探头。 9. 超声凝胶放置在小鼠头和超声探头之间，提供它们之间的声耦合。 10. 伺服电机驱动晶须刺激器。伺服电机由Arduino Uno卡控制，该卡通过TTL信号（1）与Iconeus One系统连接，以使刺激模式与成像序列同步。 三. 说明不同的空间采样可能性（使用 BioRender.com 创建）：在每种情况下，探头从第一个位置步进到最后一个位置，并在每个位置记录多普勒图像以重建堆叠体积。在整个采集过程中，此过程不断重复。密集扫描（左）：切片之间的步长必须足够小（通常为400μm，对应于仰角分辨率）以允许体积成像。稀疏扫描（右）：如果以远处的功能区域为目标（在不同的位置），也可以减少空间采样，以对与这些区域相交的不同切片进行成像，同时不影响时间采样。请点击此处查看此图的放大版本。 3. 探头定位 启动软件（例如，IcoScan）并创建实验会话。转到 “移动探头 “菜单，使用导航键盘调整超声探头的位置。注意：探头应放置在动物头部上方约1毫米处。在开始任何成像序列之前，确保探针与超声凝胶接触至关重要。 开始 实时取景 ，并在需要时通过动物CBV（脑血容量）的实时成像来调整探针位置。将大脑对齐在图像的中心。优化成像参数以捕获最高的信噪比。注意：在清醒的小鼠实验中，需要减小孔径大小以避免由侧向肌肉收缩引起的伪影。 4. 血管造影扫描和地图集配准 在采集软件中打开Angio 3D选项。在预设面板上，调整扫描参数（第一片，最后一片和步长）以扫描整个大脑（图3A，B），并开始采集。注意：设置扫描参数时，请确保扫描将覆盖大脑的后部 将采集软件保持打开状态，启动软件进行数据分析和可视化（例如，IcoStudio），然后加载血管 3D 扫描。使用3视图面板浏览采集体积，然后选择 日冕扫描方向：前后或后前。 转到 大脑注册面板。加载注册过程所需的鼠标参考模板。使用全自动或手动配准模式在 Allen 鼠标通用坐标框架 上注册扫描（图 3C）。 通过查看血管 3D 扫描和参考模板的叠加，或使用 Atlas 管理器 面板查看扫描和 Allen 参考图集的叠加来检查结果（图 3D）。将注册另存为 .bps 文件。注意：注册文件可以重复用于在同一实验会话期间执行的任何其他采集。 5. 大脑定位系统 在IcoStudio软件中，确保加载了血管造影扫描及其.bps文件（在 步骤4.4中生成）。 转到 大脑导航面板。在 “Atlas 管理器 “面板中，使用父/子树导航器浏览鼠标 Allen 脑图集 。找到解剖学目标区域并选择它们以将它们叠加到3视图中的扫描中。 在 3 视图面板中可视化目标区域，并选择与实验的目标区域重叠的成像平面。为此，请在日冕位置手动设置两个标记，其中包括感兴趣的区域。 单击 大脑定位系统 （BPS）以提取生成的运动坐标。这些坐标对应于允许对目标平面进行成像的探头位置。检查从血管造影扫描中计算出的图像的预览。 在IcoScan软件中，进入 探头定位 面板，然后单击 输入BPS坐标。应用 步骤 5.4中给出的坐标。探头在目标成像平面上移动和对齐。 执行实时取景并检查当前成像平面是否与 步骤5.4中给出的预测相对应。注意：也可以选择矢旁/非正交平面。 图3：快速经颅血管造影扫描和脑配准，用于精确定位探针。一个。 在快速血管造影扫描期间，由超声探头从第一个日冕切片（绿色）到最后一个日冕切片（蓝色）经颅扫描的小鼠大脑的示意图。当前成像的切片（以红色表示）从大脑的背面（绿色）到前部（蓝色）一步一步地移动。使用 BioRender.com B. Angio 3D 面板中 IcoScan 采集软件的屏幕截图创建。右侧的预设参数可配置快速扫描。必须正确选择第一个切片，最后一个切片的位置（以毫米为单位）以线性扫描整个大脑。 三. IcoStudio 处理软件的屏幕截图。快速的Angio 3D扫描会自动注册到小鼠大脑的参考模板中。三视图（左）显示了脉管系统和小鼠脑艾伦图谱在日冕、矢状和轴向视图中的叠加。 四. 来自3D血管造影扫描的16个切片（共31个）的线性布局（蒙太奇），注册的Allen参考图谱叠加到脉管系统上。 E. 大脑导航面板的屏幕截图显示了对应于软件计算的运动坐标的预测成像平面，这要归功于放置在左右初级躯体感觉皮层中心的两个标记，桶场区域。请点击此处查看此图的放大版本。 6. 任务诱发实验：晶须刺激 预先定义刺激顺序，包括刺激时间、刺激间时间和重复次数。 通过定义采集的总时间、位置数以及位置之间的死区时间来运行 3D fUS 序列。如果通过TTL输入与采集系统同步的自动刺激，请在开始采集之前选择 Trig-IN 选项。注意：对于这项工作中的结果，使用棉签进行刺激，例如允许大多数晶须在背侧/腹侧方向偏转。它被固定在由Arduino UNO卡驱动的伺服电机上，连接到Iconeus One系统以确保同步。推荐的刺激参数为 30 s ON、30 s OFF、振幅为 20° 和 4 Hz 频率。或者，也可以通过在采集过程中在定义的时间偏转晶须来手动提供刺激。 在IcoStudio软件中打开采集，然后进入 激活地图 菜单。使用开始时间和结束时间填充激活模式字段，并计算激活映射。调整显示参数以进行可视化。将激活映射导出为 .h5 文件以进行脱机分析。注意：使用广义线性模型（GLM）方法估计激活，其刺激由默认小鼠血流动力学反应（HRF）卷积。或者，可以通过估计刺激模式与来自每个体素的血流动力学信号之间的Pearson相关性来直接可视化激活。 7. 4D功能连接 通过定义采集的总时间、成像平面位置的数量以及位置之间的死区时间来运行 3D fUS 序列。注意：对于 4D 功能连接，我们建议每个体积之间的采集时间 180）。 保存采集并将其加载到IcoStudio软件中。如有必要，请加载 .bps 文件和 Allen 鼠标大脑坐标框架。在 地图集管理器中，选择地图集的区域作为感兴趣区域 （ROI）。 进入 功能连接 菜单，然后在 ROI 管理器中选择所需的区域。将结果可视化为连通性矩阵（监督分析）或基于种子的相关性图（无监督）。根据需要选择并调整带宽滤波器，并导出相关结果以进行统计分析。注：在3D fUS成像模式下，相对探头位置是手动设置的。因此，可以根据功能应用选择两种类型的扫描：密集扫描与稀疏扫描（图2C）。