성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

동물의 희생은 동물 실험에 대한 국가 규정에 따라 수행되어야한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 노화에 라이프 니츠 연구소의 지침에 따라 수행되었다 – 프리츠 리만 연구소와 유럽 연합 (EU) 지침 2010/63 / EU (장기 수확라이센스 번호: O_JvM_18-20). 프로토콜의 필수 단계는 그림 1로요약됩니다. 1. 문화 판, 미디어 및 파스퇴르 파이펫 준비 참고: 단일 근섬유를 분리하고 배양하는 데 필요한 모든 재료와 장비는 가능한 한 멸균되어야 합니다. 따라서, 반멸 해부 후드 에서 단일 심섬유를 분리하는 것이 좋습니다. 멸균 HS(말 세럼)를 사용하여 조직 배양 판을 코팅하십시오. 코팅은 플라스틱 표면에 단일 심섬유의 부착을 방지합니다. 각 마우스에 대해, 격리를 위한 12웰 플레이트의 4웰과 배양을 위한 24웰 플레이트의 전용 수의 우물이 필요합니다. 1mL로 12웰 플레이트의 우물과 RT(실온)에서 5분 동안 HS0.5mL의 24웰 플레이트의 우물을 배양한 다음 HS를 제거하고 접시를 5분 더 건조하게 합니다.참고: HS는 멸균을 보관하는 경우 코팅 목적으로 여러 번 수집 및 재사용할 수 있습니다. DMEM(덜벡코의 수정독수리 배지 4.5g/L 포도당 및 피루바테 나트륨)을 20%의 FBS(태아소 혈청)로 보충하여 근섬유 절연 매체를 준비, 0.22 μm 필터를 통해 필터. 미리 코팅된 절연 플레이트(12웰 플레이트, 웰당 2-4mL 절연 배지)에 배지를 넣고 5%CO2를가진 가습된 37°C 인큐베이터에서 격리 및 평형화하기 전에 약 30분 동안 분리한다. DMEM(덜벡코의 수정독수리 배지 4.5g/L 포도당 및 피루바테 나트륨)을 20%의 FBS(태아소 혈청)와 1%의 닭배아 추출물로 보충하여 근섬유 배양 배지를 준비하여 0.22 μm 필터를 통해 필터를 준비한다. 전코팅된 배양판(24웰 플레이트)의 각 웰에 0.5mL 배지를 넣고 5%CO2로가습된 37°C 인큐베이터에서 격리및 평형화하기 전에 약 30분 동안 분리한다. DMEM(4.5g/L 포도당 및 피루바테 나트륨)의 DMEM(Dulbecco의 수정된 독수리 매체)에서 0.2% (w/v) 콜라게나아제 타입 1(클로스트리디움 히스토리티즘)을용해시켜 콜라게나아제 소화 용액을 준비하여 0.22m μ 필터를 통해 필터를 준비합니다. 두 EDL(엑스텐소 디포럼 롱투스)근육은 멸균 15 mL 반응 튜브에 2.5 mL 콜라게나제 용액을 사용합니다. 또한, 격리를 시작하기 전에 37°C에서 순환 수조에서 용액 ~10분 미리 가열한다. 콜라게나아제 소화 근육의 트리튜레이션을 위해 멸균 파스퇴 파이펫을 준비합니다. 다이아몬드 펜을 사용하여 파스퇴르 파이펫을 자른다. 각 마우스에 대해, 약 0.3cm의 개구부와 약 10-12cm의 길이와 약 0.1cm의 작은 개구부와 약 22cm(도 2F)의길이와 두 번째 유리 파이펫1개의 큰 보어 파이펫을 사용한다. 분젠 버너의 불꽃으로 열을 연마하여 두 파이펫의 가장자리를 부드럽게 합니다. 파이펫 팁을 5-10s로 고정하여 부드러운 움직임으로 불꽃에 넣고 날카로운 유리 가장자리가 부드러워질 때까지 동일한 열 분포를 허용합니다. 사용하기 직전에 두 종류의 유리 파이펫을 멸균 HS로 코팅하여 전체 파이펫을 ~ 2mL의 HS를 5분 동안 채우고 HS를 배출하고 RT에서 5분 동안 파이펫을 건조시키십시오. 2. EDL 근육 격리 및 콜라게나아제 소화 오염을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 모든 장비를 분사하십시오. 동물 실험에 대한 국가 규정에 따라 마우스를 희생. 70%의 에탄올로 마우스의 뒷다리를 스프레이합니다. 경화 미세 곡선 가위 (24mm 절단 가장자리) 및 미세 한 집게 (Dumont 7, 곡선 또는 직선)를 사용하여 피부를 제거하고 기본 근육을 노출하십시오. 모피와 기본 근육의 접촉을 피하십시오 (오염의 위험을 증가시킵니다). 기본근육(그림 2A)을손상시키지 않고 미세 곡선 포셉으로 주변 근막을 제거합니다. 굽힘 방지를 위해 집게를 닫습니다. TA(티비알리스 전방)및 EDL 근육의 탈면 힘줄을 노출하기 위해 곡선 집게를 사용합니다. TA를 제거하려면, 집게와 탈면 TA 힘줄을 잡고 미세 반나스 스프링 가위로 잘라 (5mm 절단 가장자리, 0.35 mm 팁 직경). 힘줄에서 TA를 들고있는 동안, 무릎쪽으로 당겨 무릎에 가까운 근육을 잘라(그림 2B),EDL 근육이 지금 노출된다.참고: 이 단계에서는 TA 힘줄만 잡히지 만 있는지 확인하면 기본 EDL이 손상될 수 있습니다. TA 근육을 절단 할 때 무릎의 힘줄은 나중에 쉽게 볼 수 있는지 확인합니다. 미세 곡선 집게와 말단 EDL 힘줄을 들어 올리고 고급 반나스 스프링 가위로 잘라(그림 2C). 조심스럽게 무릎쪽으로 EDL을 당겨 근위 EDL 힘줄을 노출. 미세 반나스 스프링 가위로 근위근을 잘라냅니다. 15mL 반응튜브에서 콜라게나아제 소화용액의 37°C 예열된 2.5mL로 EDL 근육을 1.4단계에서 이송한다. (그림2D).참고: 근위 EDL 힘줄을 완전히 노출시키기 위해 외부 무릎 결합 조직에서 작은 절개를 합니다. 힘줄을 잡고 EDL을 너무 많이 늘리지 않도록하십시오. 2.3 단계를 반복합니다. 2.6. 두 번째 EDL. 2.5 mL 콜라게나아제 소화 용액으로 채워진 동일한 15 mL 반응 튜브에 EDL 근육을 모두 추가합니다. 순환 하는 수조에서 37°C에서 반응 관에서 EDL 근육을 배양.참고: 잠복기는 콜라게나아제 활동, 마우스의 나이 및 섬유조직의 양과 같은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 성인 마우스의 EDL 근육에 대한 전형적인 잠복기 (2-6 개월)는 1-1.5 h이며 숙성 마우스 (18 개월) 1.5-2 h입니다. 근육의 과도한 소화를 피하려면 소화 시간 동안 근육을 확인하십시오. 근육이 느슨해지고 단일 심섬유가 보이면 소화를중지하십시오(그림 2E). 큰 보어 파이펫으로 근육을 신중하게 이송하여 심섬유 절연배지(도 2G)를함유한 예온된 12웰 플레이트의 첫 번째 웰로 근육을 옮긴다. 3. 심섬유 절단 및 문화 다음 단계에 는 스테레오 쌍안경 현미경을 사용하여 가열 판(37°C)을 우선적으로 장착한다. 큰 보어 파이펫을 사용하여 단일 심섬유가 방출될 때까지 따뜻한 절연 매체로 근육을 플러시합니다. 원하는 수의 근섬유제가 용액에 자유롭게 떠오를 때까지 큰 보어 파이펫으로 근육을 분리합니다.참고: 심근섬유가 손상될 위험을 줄이기 위해 과도한 트리튜레이션을 피하십시오. 근섬유질 단화를 위해 가열판을 사용하는 것은 격리 과정에서 온도가 떨어지기 때문에 근섬유성 사망을 초래할 수 있습니다. 비계약근섬유(도2H)를HS 코팅된 소형 보어 유리 파이펫으로 이송하여 격리 매체로 잘 채워진 이물질을 씻어내고 수축(손상된) 심오섬유(도2I).참고: 격리된 심근섬유의 과도한 이동을 피하기 위해, 두 번째 우물로 옮겨진 다음 트리튜레이션 과정을 계속할 수 있다. 다음 (3rd)로비계약 심근섬유를 전송하여 격리 매체로 잘 채워져 다시 씻습니다. HS로 코팅된 소형 보어 유리 파이펫을 사용하여 약 50-100개의 비계약 근섬유를 근섬유 배양 배지를 함유한 24웰 플레이트로 이송한다. 37°C에서 심섬유를 배양하고, 전용 시간 동안 5% CO2(최대 96시간 권장).참고: MuSC는 42h의 문화 후에 한 번 평면 또는 액면베이스를 나눕니다. 또한, 72h의 문화 MuSCs가 자체 갱신, 증식 또는 커밋(차별화된) MuSC로 구성된 다세포 클러스터를 형성한 후. 4. siRNA 트랜스페션 4h 심섬유 절연 후, 500 μL 배양 배지로 채워진 24웰 플레이트 중 1개 에서 50-100개의 비계약 심섬유(50-100 비계약 심섬유)와 지질계 성 형질 계열 시약, 예를 들어 RNAiMAX는 최종 농도가 5pmol sRNAii의 최종 농도를 가진 제조업체의 프로토콜에 따라. 따라서, 25 μL의 시RNA를 각각 25 μL에 25 μL 옵티-MEM을 추가하여 1.5 μL의 트랜스펙트 시약을 함유한다. 반응 혼합물을 5분 동안 배양한 다음 배양 배지의 500 μL에 추가합니다.참고: 24h 또는 48h 이후의 두 번째 형체는 48h 이상인 긴 배양 기간에 권장됩니다. 대입 후 배지의 변경은 필요하지 않습니다. 5. 고정 및 IF 염색 면역 염색을 위해 스테레오 쌍안경 현미경을 사용합니다. 다음 단계의 모든 부피가 24웰 플레이트의 한 웰로 조정됩니다. HS 코팅된 작은 보어 파이펫을 사용하여 다음 단계를 모두 수행합니다. 골에 일부 용액을 남기면서 근섬유 배양 배지를 조심스럽게 폐기하십시오(24웰당 약 100μL). 근섬유섬유의 부동을 허용하기 위해 달리 명시되지 않는 한 모든 추가 단계에 대해이 작업을 수행합니다. 인접한 MuSC로 심섬유를 수정하기 위해 2% PFA의 500 μL을 추가하고 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 PBS (PH 7.4, 500 μL)로 심섬유를 세 번 씻으시면 RT에서 5 분 동안 하십시오. 500 μL permeabilization 솔루션(0.1% 트리톤 X-100, PBS0000, 0.1 M 글리신, pH 7.4)을 RT에서 10분 동안 배양합니다. 투과성 용액을 제거하고 RT에서 1h에 500 μL 차단 용액(PBS의 5% HS, pH 7.4)을 추가합니다.참고: 특이하지 않은 결합을 피하기 위해 1차 항체에 권장되는 차단 솔루션을 확인하십시오. 차단 용액을 제거하고 1차 항체 희석의 300 μL(예를 들어, 항팍스7(PAX7, DSHB, 희석), 항묘드(클론 G-1, 산타 크루즈, 1:200)를 잘 첨가한다. 하룻밤 동안 4 °C에서 배양하십시오. 우물 당 PBS500 μL로 세 번 세척하십시오 (RT에서 5 분). PBS를 제거하고 300 μL의 이차 항체 희석(예: 항 마우스-IgG1-546 및 항 마우스-IgG2b-488 1:1000)을 잘 추가한다. 빛으로부터 보호된 RT에서 1h를 배양합니다. 다음 단계의 경우 조명 을 줄이는 조건을 권장합니다. 우물 당 PBS500 μL로 두 번 세척하십시오 (RT에서 5 분). RT에서 5분 동안 우물당 500 μL의 용액(최종 DAPI 농도 10 μg/mL)을 사용하여 DAPI 염색을 수행합니다. 우물 당 PBS500 μL로 두 번 세척하십시오 (RT에서 5 분). 소수성 펜을 사용하여 현미경 유리 슬라이드에 원을 그리면 심섬유를 함유한 액체의 유출을 방지하는 물 방충제 장벽을 만듭니다. 현미경 유리 슬라이드에 가능한 가장 작은 부피의 근섬유를 옮기고 유리 슬라이드에 분산시십시오.참고: 미세한 유리 슬라이드를 통해 근섬유를 물리적으로 당기는 것을 피하십시오. 작은 지터 파스퇴르 파이펫 또는 200 μL 파이펫으로 잔류 액체를 제거합니다. 수성 장착 매체 2방울을 사용하고 근섬유를 커버슬립으로 덮습니다. 제조업체가 권장하는 시간 동안 슬라이드를 건조시키십시오. 슬라이드를 어둠 속에서 4°C로 저장합니다.