우리는 바이러스와 같은 입자 내에서 Cas9/단일 가이드 RNA(sgRNA) 리보뉴클레오단백질 복합체를 로드하기 위한 간단하고 저렴한 프로토콜을 개발했습니다. “나노 블레이드”라고 불리는 이러한 입자는 생체 내에서뿐만 아니라 불멸의 및 1 차 세포에서 Cas9 / sgRNA 복합체를 효율적으로 전달 할 수 있습니다.
클러스터된 짧은 palindromic 반복(CRISPR)-Cas 시스템은 진핵 세포에서 게놈 편집을 민주화하고 수많은 혁신적인 응용 분야의 개발로 이어졌습니다. 그러나, 표적 세포로 Cas9 단백질 및 단하나 가이드 RNA(sgRNA)를 전달하는 것은 기술적으로 도전이 될 수 있다. 렌티바이러스(LV) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)에서 유래된 것과 같은 고전적인 바이러스 벡터는 Cas9 단백질및 그 관련 sgRNA를 위한 코딩된 트랜스게놈의 효율적인 전달을 허용하며, 많은 1차 세포및 생체내에서. 그럼에도 불구하고, 이들 벡터는 표적 세포 게놈내의 트랜스진의 통합, 제한된 화물 용량, 표적 세포에서 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 장기 발현 과 같은 단점을 겪을 수 있다.
이러한 문제 중 일부를 극복하기 위해, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)를 기반으로 한 전달 벡터는 임의의 코딩 트랜스진이 없는 경우 Cas9 단백질 및 그 관련 가이드 RNA를 포장하기 위해 개발되었다. Cas9 단백질을 MLV로부터 구조 단백질 개그의 C-종자에 융합시킴으로써, Cas9 단백질과 sgRNA(“나노블레이드”라는 이름으로 명명된)로 적재된 바이러스와 같은 입자(VLP)가 형성되었다. 나노 블레이드는 생산자 세포의 배양 배지로부터 수집될 수 있고, 정제, 정량화, 표적 세포를 변환하고 활성 Cas9/sgRNA 복합체를 전달하는 데 사용될 수 있다. 나노 블레이드는 광범위한 원차 및 불멸의 세포에서 리보뉴클레오단백질(RNP) 화물을 일시적이고 빠르게 전달하며 수정된 Cas9 단백질을 사용하여 표적 유전자의 일시적인 전사 활성화와 같은 다른 응용 분야에 프로그래밍될 수 있습니다. 나노 블레이드는 주입 된 성인 마우스의 간및 우발 동물에서 생체 내 게놈 편집을 통해 형질 전환 동물을 생성 할 수 있습니다. 마지막으로, 그들은 “트랜스트랜스프리” 동성애 지향 수리를 위한 기증자 DNA로 복잡해질 수 있습니다. 나노 블레이드 제제는 간단하고 상대적으로 저렴한 비용으로 모든 세포 생물학 실험실에서 쉽게 수행 할 수 있습니다.
다른 프로그래밍 가능한 뉴클레아제와 비교하여 CRISPR-Cas 시스템은 진핵 세포에서 서열 특이적 게놈 표적화 및 분열 의 절차를 극적으로 단순화하고 민주화시켰습니다. sgRNA의 간단한 발현을 통해 사용자는 거의 모든 세포 궤적1에 대해 Cas9 단백질(또는 최적화된 변형)을 프로그래밍할 수 있습니다. 이 시나리오에서, Cas9 단백질과 sgRNA의 전달은 사이트 지향 돌연변이 발생을 수행할 때 주요 한계가 됩니다. 불멸의 세포에서, sgRNA와 Cas 단백질은 대부분의 세포에서 효율적인 게놈 표적을 달성하기 위하여 전과된 플라스미드에서 쉽게 발현될 수 있습니다. 그러나, Cas9/sgRNA 복합체의 구성발현은 Cas9 단백질의 오프타겟 활성을 증가시키고 비특이적 loci2에서 원치 않는 변화를 도입할 수 있다. 1 차 적인 세포에서, DNA 형질은 달성하고 가난한 발현 또는 전형된 세포의 작은 백분율로 이끌어 내는 기술적으로 어려울 수 있습니다. 고전적인 DNA 형질전환에 대한 대안은 합성 sgRNA에 결합된 재조합 Cas9 단백질의 Cas9 및 sgRNA 또는 전기포기용 트랜스진 코딩을 전달하는 바이러스 벡터의 사용을 포함한다. 그러나, 이들 접근법은 세포 숙주 게놈 내의 유전자 통합(고전적인 레트로바이러스 및 렌티바이러스 발현 벡터의 경우와 같이), 세포 요인에 의한 제한, Cas9 단백질 및 sgRNA의 구성발현으로 이어질 수 있다.
Cas9/sgRNA RNP 복합체의 전기포공은 이러한 문제의 대부분을 극복하고 1차 세포및 생체 내에서 효율적이고 일시적인 전달로 이어질 뿐만 아니라 용량 의존적 반응을 허용할 수 있다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 일반적으로 비싼 장비 및 시약에 의존 하 고 또한 많은 수의 세포를 치료 해야 하는 경우 고급 화 하기 어렵다. 전술한 기술에 대한 대안으로, 이들 저자는 다른 바이러스 유래 캡시드 단백질 전달 시스템과 개념적으로 유사한 Cas9 단백질 및 sgRNA3를 위한 레트로바이러스 전달 벡터인 “Nanoblades”를 개발하였다4,5,6,7,8. 나노 블레이드는 소세포 배지9에서 방출되는 배양 세포, VLP에서 단독으로 발현될 때 레트로 바이러스로부터 개그 폴리 프로틴의 자연적인 용량을 이도합니다. Murine 백혈병 바이러스(MLV)의 C-말단 끝에 Cas9 단백질을 융합하고 sgRNA 및 바이러스 봉투 당단백질을 공동 발현함으로써, Cas9 단백질은 방출된 VLP 또는 나노블레이드 내에서 캡슐화될 수 있다. 정화 시, 나노블레이드는 표적 세포로 배양되거나 생체 내에서 주입되어 Cas9/sgRNA RNP 콤플렉스3의 신속하고 일시적이며 용량 의존적 전달을 중재할 수 있다.
나노 블레이드는 다른 loci또는 Cas9 변형으로 동시에 편집하기 위해 여러 sgRNA로 프로그래밍하여 대상별 전사 활성화 또는 억압3과 같은 다른 응용 프로그램을 수행할 수 있습니다. 재조합 발현에 의존하는 단백질 전기포레이션과는 달리, 문헌에서 새로 설명된 Cas 변종은 개그 융합 발현 벡터로 쉽게 복제되어 다재다능한 플랫폼이 될 수 있다. 나노 블레이드는 더 복잡하거나 편성 지향 수리를 수행하기 위해 단일 좌초 및 이중 좌초 올리고열뉴클레오티드 (ssODNs)로로드 될 수 있습니다3. 나노 블레이드 생산은 상대적으로 간단하고 저렴합니다. 또한 나노 블레이드는 며칠 동안 4 °C 또는 장기 저장을 위해 -80 °C에서 저장할 수 있습니다. 전형적으로, 나노 블레이드는 대부분의 불멸과 1 차 배양 세포에서 효율적이고 유전자없는 게놈 편집을 중재합니다. 그러나, 몇몇 1 차적인 세포는 증가한 사망의 결과로 바이러스성 입자의 존재에 민감할 지도 모릅니다. 타고난 면역 계통의 세포는 또한 나노 블레이드의 존재에 반응할 수 있습니다 (그들의 바이러스 기원 때문에) 활성화 될 수 있습니다. 이러한 경우 트랜스듀션 프로토콜은 나노블레이드에 대한 노출 시간을 제한하고 비특이적 효과를 최소화하도록 최적화되어야 합니다. 나노 블레이드는 다른 사용 가능한 CRISPR 전달 방법에 대한 실행 가능하고 구현하기 쉬운 대안을 나타냅니다.
나노 블레이드는 세포주 및 1 차 세포에서 Cas9/sgRNA RNP 복합체의 신속하고 복용량 의존적인 납품을 허용합니다. 고전적인 트랜스페션 및 기타 바이러스 성 전달 벡터와는 달리 단백질 전기화와 마찬가지로 나노 블레이드는 트랜스진이없는 방식으로 Cas9 /sgRNA RNP의 일시적인 전달의 이점이 있습니다. 나노 블레이드는 CRISPR 변종의 계속 확장 제품군에 쉽고 빠르게 적응 할 수있는 단백질 전달을위한 매우 다재다능하고 간단하며 저렴한 플랫폼을 제공합니다. 나노 블레이드는 HEK293T 세포주 또는 그 유도체에서 생성될 수 있다. 여기에 사용되는 HEK293T 세포주 레트로 바이러스 및 렌즈바이러스 입자 생산을 극대화하기 위해 개발되었습니다 ( 재료의 표 참조). 그러나 HEK293T 세포의 다른 공급원이 적합할 수 있지만, 사용자는 HEK293T 세포원에 따라 입자 생산의 주요 차이점이 관찰됨에 따라 다양한 소스에서 HEK293T 세포를 테스트하고 비교해야 한다. 세포는 또한 입자 생산에 부정적인 영향을 미치는 과응영향을 피하기 위해 Mycoplasma 오염을 자주 검사하고 3 일마다 통과 (고전적으로 1/8 희석) 통과.
세포는 20개 이상의 구절을 위해 유지관리해서는 안 됩니다. 포도당, 페니실린/연쇄절제술, 글루타민, 10% 보완된 태아 소 혈청으로 보충된 DMEM은 세포 배양에 사용되었다. 혈청 원점은 나노 블레이드 준비의 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 혈청의 다른 배치는 대규모 생산 전에 테스트되어야한다. 나노 블레이드는 RPMI 또는 혈청없는 최소 필수 매체의 수정과 같은 다른 매체에서 효율적으로 생성 할 수 있으며, 이는 전환 후 당일 DMEM을 대체 할 수 있습니다. 아래에 표시된 바와 같이, 일부 DNA-transfection 시약과의 트랜스페션 후 중간 교체가 선택 사항이지만, 특히 입자 제제에서 혈청 흔적을 제한하는 것이 도움이 될 수 있다. 그러나, 감산의 최소 필수 배지에서 세포의 재배는 아직 시도되지 않았습니다.
언급했듯이, 나노 블레이드는 생산자 세포에서 플라스미드혼합물의 과발현시 생산된다. 최적의 생산에 과식이 필요한 것으로 보입니다. 실제로, 이 실험실은 개그폴 표현 구조가 항생제 선택에 의해 안정화된 생산자 세포줄을 개발했습니다. 그러나 이 시스템은 상당한 양의 나노 블레이드를 생성하지 못했습니다. 유사한 관찰은 sgRNA 코딩 구조가 생산자 세포의 게놈에 안정적으로 통합되었을 때 이루어졌다. 다른 입자 생산 시스템에 설명된 바와 같이, 나노블레이드 생산에 관여하는 적어도 일부 구조물을 발현하는 안정적인 세포주; 그러나, 이것은 확실히 입자를 정화하기 위하여 대량의 상체그리고 적당한 기술의 처리가 필요합니다. 위의 프로토콜은 특정 형질 전환 시약을 악용하는 나노 블레이드를 생성하는 기본 절차를 간략하게 설명 합니다(재료 표 참조).
다른 제조 업체에서 트랜스페션 시약도 성공으로 테스트되었지만, 나노 블레이드와이 그룹의 결과의 대부분은 여기에 설명 된 절차를 따릅니다. 저비용 트랜스페션은 칼슘 인산염 시약을 사용하여 달성되고 좋은 생산 효율을 얻을 수 있습니다. 그러나, 이 방법은 절대적으로 형질 전환 후 당일에 형질계의 교체가 필요하며 퇴적입자 제제에 칼슘 인산염 잔류물을 남길 수 있다. 생산자 세포 내의 나노 블레이드 성분에 대한 높은 발현 수준의 필요성과 일치하여 Cas9 단백질과 관련된 sgRNA의 양이 효율적인 게놈 편집을 위한 제한 인자가 될 수 있다는 관측이 있다. sgRNA 로딩을 개선하기 위해, 최근 나노 블레이드와 유사한 단백질 전달 벡터를 사용하여 독립적 인 그룹에 의해 두 가지 기술적 인 접근 이 개발되었습니다. 이들은 SgRNA6의 T7 폴리머라제 의존세포형 발현의 사용또는 개그 폴리프로틴6에 결합을 중재하기 위해 sgRNA 서열에 레트로바이러스 캡슐화 신호를 첨가함으로써 의존한다. 이러한 접근 방식은 아직 테스트되지 않았지만 나노 블레이드 내의 sgRNA 로딩을 실제로 향상시킬 수 있습니다.
표적 세포의 변환은 절차에서 중요한 단계입니다. 대부분의 불멸의 세포주에서 나노 블레이드와의 트랜스포션은 세포 병증 효과가 거의 또는 전혀 없습니다. 그러나, 1 차적인 세포에서, 독성은 문제가 될 수 있습니다. 따라서 트랜스유도는 각 셀 유형에 최적화되어야 합니다. 특히, 나노블레이드에 대한 노출 시간은 트랜스듀션 프로토콜을 최적화할 때 수정하는 중요한 요소입니다. 1차 뉴런 이나 골수 세포와 같은 민감한 세포의 경우, 매체를 교체하기 전에 나노 블레이드와 인큐베이션의 4-6 h는 세포 독성을 최소화하면서 Cas9 단백질의 효율적인 전달을 허용합니다. 더욱이, 양이온 폴리머와 같은 보조제는, 그 외의 사이에서, 몇몇 세포에 있는 전도의 효율성을 현저하게 향상할 수 있습니다 ( 재료의 표 참조). 나노 블레이드는 VLP이며 면역 원성 반응을 유도 할 수 있음을 주목하는 것이 중요합니다. 이것은 나노 블레이드와 함께 잠복이 유전자 발현및 세포의 표현형에 있는 중요한 변경을 유도할 수 있는 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 1 차적인 세포의 특정 모형으로 일하는 경우에 제한일 수 있습니다. 대식세포와 수지상 세포가 조혈 줄기 세포 전구체(예: 마우스 골수 세포)로부터 유래되는 경우 나노블레이드에 대한 세포 반응을 유도하지 않도록 완전히 분화되기 전에 나노블레이드로 세포를 전도하는 것이 바람직하다. 그렇지 않으면, Cas9 단백질 전기 화는 분화 된 면역 세포와 함께 작업 할 때 실행 가능한 대안을 나타낼 수 있습니다.
나노 블레이드는 형질 전환 동물을 생성하기 위해 마우스 zygotes 또는 배아를 변환하는 생체 내에서 사용할 수 있습니다. 고전적인 레트로 바이러스 또는 렌즈 바이러스 벡터와 유사, 그들은 또한 성인 동물에서 조직에 직접 주입 될 수 있습니다. 그러나, 나노블레이드(레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터와 유사)는 숙주 동물의 면역 반응에 의해 비활성화될 수 있다. 따라서, 주입되는 복용량은 각 응용 프로그램에 대해 최적화되어야한다. 이러한 면역 반응은 또한 주사 부위에 가까운 조직에 기능적인 VLP의 분포를 제한할 수 있다. 마지막으로, 렌즈피바이러스 벡터와 달리 나노블레이드는 트랜스진이 없으며 제한된 기간 내에 Cas9를 제공합니다. 따라서, 그(것)들은 세포의 선택에 sgRNAs의 높은 처리량 순서를 요구하는 게놈 전체 기능 검열을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 없습니다. 나노 블레이드는 급속한 경우 유용, 복용량 의존, 및 트랜스 유전자없는 게놈 편집이 필요한 20. 더욱이, 단백질 전기화와 유사하게, 나노블레이드는 DNA 트랜스페션 또는 고전적인 바이러스 벡터3를 통해 Cas9/sgRNA의 장기간 발현보다 더 적은 오프 타겟 효과로 이끌어 내는다3. 나노 블레이드의 미래 개발은 베이스 편집 및 RNA 타겟팅과 같은 다양한 기술 응용 분야에 대한 Cas9 변종을 통합하는 데 초점을 맞추고 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR) 후원 FINOVI, 응용 프로그램 인베세멘트 다베니르 (ANR-11-IDEX-0007) 내에서, 대학 드 리옹의 라벡스 에코펙트 (ANR-11-LABX-0048)에 의해 투자되었다 기관 내셔널 데 Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) 및 유럽 연구 위원회 (ERC-StG-LS6-805500 to E.P.R.) 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램.
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |