We hebben een eenvoudig en goedkoop protocol ontwikkeld om Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteïnecomplexen in virusachtige deeltjes te laden. Deze deeltjes, genaamd “Nanoblades”, maken een efficiënte levering van het Cas9 / sgRNA-complex mogelijk in onsterfelijke en primaire cellen, evenals in vivo.
Het geclusterde, regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas-systeem heeft genoombewerking in eukaryote cellen gedemocratiseerd en geleid tot de ontwikkeling van tal van innovatieve toepassingen. De afgifte van het Cas9-eiwit en single-guide RNA (sgRNA) in doelcellen kan echter technisch een uitdaging zijn. Klassieke virale vectoren, zoals die afgeleid van lentivirussen (LVs) of adeno-geassocieerde virussen (AAV’s), zorgen voor een efficiënte afgifte van transgenen die coderen voor het Cas9-eiwit en het bijbehorende sgRNA in veel primaire cellen en in vivo. Niettemin kunnen deze vectoren last hebben van nadelen zoals integratie van het transgen in het doelcelgenoom, een beperkte laadcapaciteit en langetermijnexpressie van het Cas9-eiwit en gids-RNA in doelcellen.
Om een aantal van deze problemen te overwinnen, werd een toedieningsvector op basis van het muizenleukemievirus (MLV) ontwikkeld om het Cas9-eiwit en het bijbehorende gids-RNA te verpakken in afwezigheid van een coderend transgen. Door het Cas9-eiwit te fuseren met de C-terminus van het structurele eiwit Gag uit MLV, werden virusachtige deeltjes (VLP’s) geladen met het Cas9-eiwit en sgRNA (genaamd “Nanoblades”) gevormd. Nanoblades kunnen worden verzameld uit het kweekmedium van productiecellen, gezuiverd, gekwantificeerd en gebruikt om doelcellen te transduceren en het actieve Cas9 / sgRNA-complex af te leveren. Nanoblades leveren hun ribonucleoproteïne (RNP) lading tijdelijk en snel af in een breed scala aan primaire en onsterfelijke cellen en kunnen worden geprogrammeerd voor andere toepassingen, zoals voorbijgaande transcriptionele activering van gerichte genen, met behulp van gemodificeerde Cas9-eiwitten. Nanoblades zijn in staat tot in vivo genoombewerking in de lever van geïnjecteerde volwassen muizen en in eicellen om transgene dieren te genereren. Ten slotte kunnen ze worden gecomplexeerd met donor-DNA voor “transfectievrij” homologiegericht herstel. Nanoblade-voorbereiding is eenvoudig, relatief goedkoop en kan gemakkelijk worden uitgevoerd in elk celbiologisch laboratorium.
In vergelijking met andere programmeerbare nucleasen heeft het CRISPR-Cas-systeem de procedure van sequentiespecifieke genoomtargeting en splitsing in eukaryote cellen drastisch vereenvoudigd en gedemocratiseerd. Door de eenvoudige expressie van een sgRNA kunnen gebruikers het Cas9-eiwit (of geoptimaliseerde varianten) programmeren voor bijna elke cellulaire locus1. In dit scenario wordt de afgifte van het Cas9-eiwit en sgRNA de belangrijkste beperking bij het uitvoeren van locatiegerichte mutagenese. In onsterfelijke cellen kunnen het sgRNA en het Cas-eiwit gemakkelijk tot expressie worden gebracht uit getransfecteerde plasmiden om efficiënte genoomtargeting in de meeste cellen te bereiken. Constitutieve expressie van het Cas9/sgRNA-complex kan echter de off-target activiteit van het Cas9-eiwit verhogen en ongewenste veranderingen in niet-specifieke loci2 introduceren. In primaire cellen kan DNA-transfectie technisch moeilijk te bereiken zijn en leiden tot slechte expressie of een klein percentage getransfecteerde cellen. Alternatieven voor klassieke DNA-transfectie omvatten het gebruik van virale vectoren die een transgeen leveren dat codeert voor het Cas9 en sgRNA of de elektroporatie van recombinant Cas9-eiwit gekoppeld aan een synthetisch sgRNA. Deze benaderingen kunnen echter leiden tot transgene integratie in het celgastheergenoom (zoals het geval is voor klassieke retrovirale en lentivirale expressievectoren), beperking door cellulaire factoren en leiden tot constitutieve expressie van het Cas9-eiwit en sgRNA.
Elektroporatie van het Cas9/sgRNA RNP-complex kan de meeste van deze problemen overwinnen en leiden tot efficiënte en voorbijgaande toediening in primaire cellen en in vivo, evenals een dosisafhankelijke respons mogelijk maken. Niettemin is het meestal afhankelijk van dure apparatuur en reagentia en is het ook moeilijk op te schalen als een groot aantal cellen moet worden behandeld. Als alternatief voor de bovengenoemde technieken hebben deze auteurs “Nanoblades” ontwikkeld – een retrovirale toedieningsvector voor het Cas9-eiwit en sgRNA3 die conceptueel vergelijkbaar is met andere virale afgeleide capsid-eiwitafgiftesystemen4,5,6,7,8. Nanoblades maken gebruik van de natuurlijke capaciteit van het Gag-polyproteïne uit retrovirussen om, wanneer ze alleen in gekweekte cellen tot expressie worden gebracht, VLP’s te produceren die vrijkomen in het extracellulaire medium9. Door het Cas9-eiwit te fuseren met het C-terminale uiteinde van het murine leukemievirus (MLV) Gag polyproteïne en het sgRNA en virale envelop glycoproteïnen co-expressie te geven, kan het Cas9-eiwit worden ingekapseld in vrijgegeven VLP’s of Nanoblades. Na zuivering kunnen de Nanoblades worden geïncubeerd met doelcellen of in vivo worden geïnjecteerd om te bemiddelen bij snelle, voorbijgaande en dosisafhankelijke toediening van het Cas9/sgRNA RNP-complex3.
Nanoblades kunnen worden geprogrammeerd met meerdere sgRNA’s voor gelijktijdige bewerking op verschillende loci of met Cas9-varianten om andere toepassingen uit te voeren, zoals doelspecifieke transcriptionele activering of repressie3. In tegenstelling tot eiwitelektroporatie, die afhankelijk is van recombinante expressie, kunnen nieuw beschreven Cas-varianten uit de literatuur gemakkelijk worden gekloond in de Gag-fusie-expressievector, waardoor het een veelzijdig platform is. Nanoblades kunnen verder worden gecomplexeerd of geladen met enkelstrengs en dubbelstrengs oligodeoxynucleotiden (ssODN’s) om homologiegerichte reparatie uit te voeren3. Nanoblade productie is relatief eenvoudig en goedkoop. Bovendien kunnen Nanoblades vele dagen bij 4 °C worden bewaard of bij -80 °C voor langdurige opslag. Doorgaans bemiddelen Nanoblades efficiënte, transgene-vrije genoombewerking in de meeste vereeuwigde en primaire gekweekte cellen. Sommige primaire cellen kunnen echter gevoelig zijn voor de aanwezigheid van virale deeltjes, wat resulteert in verhoogde mortaliteit. Cellen van het aangeboren immuunsysteem kunnen ook reageren op de aanwezigheid van Nanoblades (vanwege hun virale oorsprong) en geactiveerd worden. In deze gevallen moet het transductieprotocol worden geoptimaliseerd om de blootstellingstijd aan Nanoblades te beperken en niet-specifieke effecten te minimaliseren. Nanoblades vormen een levensvatbaar en eenvoudig te implementeren alternatief voor andere beschikbare CRISPR-toedieningsmethoden.
Nanoblades zorgen voor een snelle en dosisafhankelijke afgifte van het Cas9/sgRNA RNP-complex in cellijnen en primaire cellen. In tegenstelling tot klassieke transfectie en andere virale toedieningsvectoren, maar net als eiwitelektroporatie, hebben Nanoblades het voordeel van voorbijgaande afgifte van de Cas9 / sgRNA RNP op een transgene-vrije manier. Nanoblades bieden een zeer veelzijdig, eenvoudig en goedkoop platform voor eiwitafgifte dat gemakkelijk en snel kan worden aangepast aan de steeds groter wordende familie van CRISPR-varianten. Nanoblades kunnen worden geproduceerd in de HEK293T-cellijn of zijn derivaten. HEK293T-cellijnen die hier worden gebruikt, zijn ontwikkeld om de productie van retrovirale en lentivirale deeltjes te maximaliseren (zie de tabel met materialen). Hoewel andere bronnen van HEK293T-cellen geschikt kunnen zijn, moeten gebruikers HEK293T-cellen uit verschillende bronnen testen en vergelijken, aangezien er grote verschillen in deeltjesproductie zijn waargenomen, afhankelijk van de HEK293T-celbron. Cellen moeten ook regelmatig worden gecontroleerd op Mycoplasma-contaminatie en om de drie dagen worden gepasseerd (klassiek 1/8 verdunning) om overconfluentie te voorkomen, wat een negatieve invloed heeft op de deeltjesproductie.
Cellen mogen niet worden onderhouden voor meer dan 20 passages. DMEM aangevuld met glucose, penicilline/streptomycine, glutamine en 10% gedecomplementeerd foetaal runderserum werd gebruikt voor celkweek. Aangezien de oorsprong van het serum de kwaliteit van het Nanoblade-preparaat kan beïnvloeden, moeten verschillende serumbatches worden getest voordat ze op grote schaal worden geproduceerd. Nanoblades kunnen efficiënt worden geproduceerd in andere media zoals RPMI of serumvrije modificaties van minimaal essentieel medium dat DMEM kan vervangen op de dag na transfectie. Zoals hieronder aangegeven, hoewel mediumvervanging na transfectie met sommige DNA-transfectiereagentia optioneel is, kan het nuttig zijn om het medium waarin de VLP’s vrijkomen te wijzigen, met name om serumsporen in het deeltjespreparaat te beperken. Het kweken van cellen in minimaal essentieel medium met verlaagd serum op de dag vóór transfectie is echter nog niet geprobeerd.
Zoals vermeld, nanobladeren worden geproduceerd na overexpressie van een mengsel van plasmiden in productiecellen. De overexpressie lijkt nodig te zijn voor een optimale productie. Inderdaad, dit laboratorium ontwikkelde een producerende cellijn waar de Gag-Pol-expresserende constructie werd gestabiliseerd door antibioticaselectie; dit systeem slaagde er echter niet in om aanzienlijke hoeveelheden Nanoblades te produceren. Een soortgelijke observatie werd gedaan toen het sgRNA-coderende construct stabiel werd geïntegreerd in het genoom van productiecellen. Zoals beschreven voor andere deeltjesproductiesystemen, kan een stabiele cellijn die ten minste enkele constructies tot expressie brengt die betrokken zijn bij de productie van nanoblades nuttig zijn; dit zou echter zeker de verwerking van grote hoeveelheden supernatant en een geschikte techniek om deeltjes te zuiveren vereisen. Het bovenstaande protocol schetst de voorkeursprocedure voor het produceren van nanobladen die gebruikmaken van specifieke transfectiereagentia (zie de tabel met materialen).
Hoewel transfectiereagentia van andere fabrikanten ook met succes zijn getest, volgt de overgrote meerderheid van de resultaten van deze groep met Nanoblades de hierin beschreven procedure. Goedkope transfectie kan worden bereikt met behulp van calciumfosfaatreagentia en levert een goede productie-efficiëntie op; deze methode vereist echter absoluut de vervanging van transfectiemedium op de dag na transfectie en kan calciumfosfaatresiduen achterlaten in het gesedimenteerde deeltjespreparaat. Consistent met de noodzaak van hoge expressieniveaus voor Nanoblade-componenten in productiecellen is de observatie dat de hoeveelheid sgRNA’s geassocieerd met het Cas9-eiwit een beperkende factor kan zijn voor efficiënte genoombewerking. Om de sgRNA-belasting te verbeteren, zijn onlangs twee technische benaderingen ontwikkeld door onafhankelijke groepen met behulp van eiwitafgiftevectoren die vergelijkbaar zijn met Nanoblades. Deze zijn afhankelijk van het gebruik van T7 polymerase-afhankelijke cytoplasmatische expressie van sgRNA6 of door de toevoeging van een retroviraal inkapselingssignaal aan de sgRNA-sequentie om binding aan het Gag-polyproteïne6 te bemiddelen. Deze benaderingen kunnen inderdaad de sgRNA-belasting in Nanoblades verbeteren, hoewel ze nog niet zijn getest.
Transductie van doelcellen is een cruciale stap in de procedure. In de meeste vereeuwigde cellijnen heeft transductie met Nanoblades weinig of geen cytopathisch effect. In primaire cellen kan toxiciteit echter een probleem zijn. Transductie moet daarom voor elk celtype worden geoptimaliseerd. Met name de blootstellingstijd aan Nanoblades is een belangrijke factor om aan te passen bij het optimaliseren van het transductieprotocol. Voor gevoelige cellen zoals primaire neuronen of beenmergcellen zorgt 4-6 uur incubatie met Nanoblades voordat het medium wordt vervangen voor een efficiënte afgifte van het Cas9-eiwit terwijl de celtoxiciteit wordt geminimaliseerd. Bovendien kunnen adjuvantia zoals kationische polymeren, onder andere, de efficiëntie van transductie in sommige cellen aanzienlijk verbeteren (zie de tabel met materialen). Het is belangrijk op te merken dat Nanoblades VLP’s zijn en een immunogene respons kunnen induceren. Dit kan een beperking zijn bij het werken met bepaalde soorten primaire cellen, zoals macrofagen of dendritische cellen, waarbij incubatie met nanobladen belangrijke veranderingen in genexpressie en het fenotype van de cellen kan veroorzaken. Als macrofagen en dendritische cellen zijn afgeleid van hematopoëtische stamcelvoorlopers (zoals beenmergcellen van muizen), verdient het de voorkeur om cellen te transduceren met de Nanoblades voordat ze volledig worden gedifferentieerd om te voorkomen dat een cellulaire respons tegen de Nanoblades wordt geïnduceerd. Anders zou Cas9-eiwitelektroporatie een levensvatbaar alternatief kunnen zijn bij het werken met gedifferentieerde immuuncellen.
Nanoblades kunnen in vivo worden gebruikt om muizenzygoten of embryo’s te transduceren om transgene dieren te genereren. Vergelijkbaar met klassieke retrovirale of lentivirale vectoren, kunnen ze ook rechtstreeks in weefsels van volwassen dieren worden geïnjecteerd. Nanoblades (vergelijkbaar met retrovirale en lentivirale vectoren) kunnen echter worden geïnactiveerd door de immuunrespons van het gastheerdier; daarom moet de te injecteren dosis voor elke toepassing worden geoptimaliseerd. Deze immuunrespons kan ook de verdeling van functionele VLP’s naar weefsels dicht bij de injectieplaats beperken. Ten slotte zijn Nanoblades, in tegenstelling tot lentivirale vectoren, transgenvrij en leveren ze de Cas9 in een beperkt tijdsbestek. Daarom kunnen ze niet worden gebruikt om genoombrede functionele screenings uit te voeren die high-throughput sequencing van sgRNA’s vereisen bij selectie van cellen. Nanoblades zijn nuttig wanneer snelle, dosisafhankelijke en transgene-vrije genoombewerking vereist is20. Bovendien leiden nanoblades, net als eiwitelektroporatie, tot minder off-target effecten dan langdurige expressie van Cas9 / sgRNA via DNA-transfectie of klassieke virale vectoren3. Toekomstige ontwikkeling van Nanoblades is gericht op het opnemen van Cas9-varianten voor verschillende technologische toepassingen zoals base-editing en RNA-targeting.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) van de Université de Lyon, binnen het programma Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007) beheerd door het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) en door de European Research Council (ERC-StG-LS6-805500 to E.P.R.) in het kader van de Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma’s van de Europese Unie.
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |