Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules fœtales du syndrome de Turner (45XO) pour la modélisation en aval des déficits neurologiques associés au syndrome

Les aneuploïdiens entraînent des malformations congénitales et des pertes de grossesse chez l’homme. ~ 50% à 70% des échantillons de pertes de grossesse présentent des anomalies cytogénétiques. Les embryons aneuploïdes perdus au début de la grossesse ne peuvent pas être facilement obtenus pour une analyse expérimentale, ce qui soulève la nécessité de développer d’autres modèles représentant étroitement l’embryogenèse humaine. Des cellules souches pluripotentes induites (CSI) dérivées de cellules diagnostiquées avec des troubles génétiques ont été utilisées pour modéliser les irrégularités génétiques représentatives et leurs conséquences sur le développement du fœtus^1,2,3,4. Ces CSPi ressemblent à des cellules épiblastiques de l’embryon en développement et peuvent récapituler les événements précoces de la formation de l’embryon. Ils permettent de comprendre et de caractériser le programme de développement des lignées cellulaires et des modèles chez les embryons de mammifères précoces. CSPi dérivées précédemment de fibroblastes cutanés et d’amniocytes provenant de tests de diagnostic prénatal de syndromes d’aneuploïdie comme la monosomie X (syndrome de Turner), la trisomie 8 (syndrome de Warkany 2), la trisomie 13 (syndrome de Patau) et la trisomie partielle 11; 22 (syndrome d’Emanuel) ont fourni des informations précieuses concernant l’échec du développement⁴.

Le syndrome de Turner (TS) est une maladie rare caractérisée par l’infertilité féminine, la petite taille, des troubles endocriniens et métaboliques, un risque accru de maladie auto-immune et une prédisposition aux maladies^{cardiovasculaires 5}. Bien qu’il s’agit du seul syndrome de monosomie survivable, il est également mortel pour l’embryon en développement provoquant des avortements spontanés⁶. Les individus survivants atteints de TS présentent des degrés d’altération du matériel chromosomique X dans leurs cellules. Les caryotypes vont de la perte complète d’un chromosome X (45,XO) à des mosaïques comme 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la présence de chromosomes annulaires, la présence de matériel chromosomique Y,^{etc. 5}.

Le diagnostic du syndrome se fait généralement par caryotypage du sang des individus symptomatiques et prélèvement de villosités chorioniques (CVS) pour détecter les syndromes d’aneuploïdie précoce. Étant donné que les syndromes d’aneuploïdie représentent environ 30% des avortements spontanés, il est courant de caryotyper le produit de la conception (POC) lors d’un avortement spontané. Ces cellules fœtales, y compris les villosités chorioniques possédant l’anomalie cytogénétique et les CSPi qui en sont dérivées, constituent une source précieuse de matériel biologique pour étudier les syndromes d’aneuploïdie^4,6. Les CSI TS ont déjà été établies à partir d’amniocytes via la reprogrammation rétrovirale^4,de fibroblastes de villosités chorioniques (obtenus par diagnostic prénatal) via une reprogrammation rétrovirale^6,de cellules mononucléaires sanguines⁷ via la reprogrammation du virus Sendai et de fibroblastes cutanés d’individus TS via une reprogrammation lentivirale⁴ . Étant donné que l’objectif principal de notre laboratoire est de comprendre l’échec du développement, nous avons généré des CST iPSC à partir de POC, en particulier la composante des villosités chorioniques d’un avortement spontané⁸. Toutes les cellules isolées de ce tissu fœtal avaient un caryotype 45XO et produisaient des CS IPC avec le même caryotype. Ces CSPe sont uniques car elles sont les premières à être générées à partir d’un fœtus avorté et constituent une ressource précieuse pour étudier les échecs de grossesse liés à l’aneuploïdie. Cet article fournit une méthodologie détaillée de la génération de CSPic à partir de cette source cellulaire unique via la reprogrammation épisomique.

Les premières méthodes de génération d’iPSC utilisaient la transduction virale et les transposons pour fournir les facteurs de reprogrammation. Les méthodes d’induction des cellules à la pluripotence ont évolué de l’intégration des vecteurs rétroviraux^9,des vecteurs lentiviraux excisables^10,11 et des méthodes basées sur les transposons¹² aux vecteurs adénoviraux non intégrateurs¹³ et aux vecteurs à base du virus Sendai^14. La reprogrammation rétrovirale et lentivirale, bien qu’efficace, implique l’intégration des facteurs de reprogrammation dans les chromosomes de l’hôte, provoquant des mutations d’insertion qui ont des effets imprévus dans les CSI. De plus, la reprogrammation virale empêche l’application translationnelle des CSI. Les systèmes à base d’ARN¹⁵ et d’administration directe de protéines¹⁶ ont été explorés pour éliminer complètement les risques potentiels associés à l’utilisation de virus et de transfections d’ADN. Cependant, ces méthodes se sont avérées inefficaces.

En 2011, Okita et al. ont rapporté une amélioration de l’efficacité de la reprogrammation par des plasmides épisomiques augmentés par la suppression de TP53 via shRNA. Ils ont également remplacé le cMYC par un LMYC (MYC associé au carcinome pulmonaire à petites cellules) non transformant pour améliorer la sécurité des hiPSC. Ces plasmides épisomiques expriment 5 facteurs de reprogrammation : OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC et shRNA pour TP53^17,18. Ces vecteurs sont maintenus extra-chromosomiquement et perdus des cellules reprogrammées lors d’une culture continue, rendant ainsi les lignes sans transgène dans 10-15 passages. La nucléofection est une forme spécialisée d’électroporation qui délivre des acides nucléiques directement dans le noyau des cellules hôtes. C’est une méthode efficace pour l’administration des plasmides de reprogrammation dans divers types de cellules. Les plasmides épisomiques sont rentables et compensent les coûts élevés de la nucléofection. Cette méthode est efficace et reproductible dans des conditions optimisées, produisant des CSP stables à partir d’une variété de cellules somatiques. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode de génération de CSI i à partir de fibroblastes isolés du tissu fœtal par nucléofection de plasmides de reprogrammation épisomique. Voici les protocoles détaillés pour l’isolement des fibroblastes des villosités chorioniques fœtales, la purification des plasmides, la nucléofection, la cueillette des colonies à partir de la plaque de reprogrammation et l’établissement de CSI stables.

Il est essentiel de confirmer la présence de traits de pluripotence dans les IPSC nouvellement générés. Cela comprend la démonstration de facteurs liés à la pluripotence (par exemple, expression de la phosphatase alcaline, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadhérine; généralement montré avec des tests d’immunofluorescence ou d’expression génique), l’identification des trois couches germinales par des tests de différenciation in vitro pour valider leurs potentiels de différenciation, le caryotypage pour déterminer le contenu chromosomique, le typage STR pour établir l’identité avec les cellules mères, vérifier la perte de gènes exogènes, et des essais in vivo plus rigoureux tels que la formation de tératome et la complémentation tétraploïde. Nous décrivons ici les protocoles de caractérisation du caryotypage, la coloration de la phosphatase alcaline des cellules vivantes, la détection de biomarqueurs liés à la pluripotence par immunofluorescence, les tests de différenciation in vitro et la méthode pour démontrer la perte de gènes exogènes¹⁹.