Actividad De Las Neuronas Aferentes De La Línea Lateral Posterior Durante La Natación En El Pez Cebra
Summary
Describimos un protocolo para supervisar cambios en la actividad aferente de la neurona durante comandos del motor en un sistema de la célula de pelo vertebrado modelo.
Abstract
Los sistemas sensoriales reúnen señales esenciales para dirigir el comportamiento, pero los animales deben descifrar qué información es biológicamente relevante. La locomoción genera señales reaferentes que los animales deben desentrañar de las señales sensoriales relevantes del entorno circundante. Por ejemplo, cuando un pez nada, el flujo generado a partir de ondulaciones corporales es detectado por los neuromastos mecanorreceptivos, que comprenden las células ciliadas, que componen el sistema de línea lateral. Las células ciliadas luego transmiten información de movimiento fluido desde el sensor al cerebro a través de las neuronas aferentes sensoriales. Simultáneamente, la descarga corolario del comando motor se transmite a las células ciliadas para prevenir la sobrecarga sensorial. Por lo tanto, tener en cuenta el efecto inhibitorio de las señales motoras predictivas durante la locomoción es fundamental a la hora de evaluar la sensibilidad del sistema de línea lateral. Hemos desarrollado un enfoque electrofisiológico in vivo para monitorear simultáneamente la neurona aferente de la línea lateral posterior y la actividad de la raíz motora ventral en larvas de pez cebra (4-7 días después de la fertilización) que pueden durar varias horas. Las grabaciones extracelulares de neuronas aferentes se logran utilizando la técnica de abrazadera de parches sueltos, que puede detectar la actividad de neuronas únicas o múltiples. Las grabaciones de la raíz ventral se realizan a través de la piel con electrodos de vidrio para detectar la actividad de la neurona motora. Nuestro protocolo experimental proporciona el potencial para monitorear los cambios endógenos o evocados en la entrada sensorial a través de los comportamientos motores en un vertebrado intacto y que se comporta.
Introduction
Las neuronas aferentes de los sistemas mechanosensoriales transmiten información de las células ciliadas al cerebro durante la audición y el equilibrio. La electrofisiología puede revelar la sensibilidad de las neuronas aferentes a través de grabaciones directas. Mientras que el parcheo de células enteras de las células ciliadas puede ser un desafío, el registro de las neuronas aferentes aguas abajo es más fácil y permite la evaluación de los potenciales de acción en respuesta a los estímulos controlados1,2,3. La estimulación de las células ciliadas conduce a su deflexión, lo que modifica las estructuras medenosensoriales, desencadenando así un aumento de los potenciales de acción (picos) en las neuronas aferentes4,5,6. En ausencia de estímulos externos, las neuronas aferentes también se disparan espontáneamente debido a la fuga de glutamato de las células ciliadas a los terminales post-sinápticos aferentes7,8,y se ha demostrado que contribuyen a mantener la sensibilidad9,10. El registro de la abrazadera de parches de la actividad aferente permite la observación de la sensibilidad de las células ciliadas y la dinámica de la señal que no son posibles utilizando técnicas con menor resolución temporal, como en microfonías11, 12 o imágenes funcionales de calcio13,14,15. El siguiente protocolo permitirá el registro de la actividad aferente concurrente con los comandos motores para revelar cambios instantáneos en la sensibilidad de las células ciliadas.
El pez cebra(Danio rerio)utiliza células ciliadas contenidas en neuromastos que componen el sistema de línea lateral para detectar el movimiento del agua en relación con su cuerpo, lo que se traduce en señales neuronales esenciales para la navegación16,17,18,evitación de depredadores, captura de presas19,20,y escolaridad21. El flujo de agua también puede ser autogenerado por los movimientos de natación22,23,24,respiración22,25,26,y alimentación27. Estos comportamientos comprenden movimientos repetitivos que pueden fatigar las células ciliadas y perjudicar la detección. Por lo tanto, es fundamental que el sistema de línea lateral diferencie entre estímulos de flujo externos (exaferentes) y autogenerados (reaferentes). Una descarga corolario atenúa las señales de flujo autogeneradas durante la locomoción en el pez cebra. Esta señal motora predictiva inhibitoria se retransmite a través de neuronas descendentes a los receptores sensoriales para modificar la entrada o interrumpir el procesamiento de la retroalimentación reaferente28,29. El trabajo seminal que contribuyó a nuestra comprensión temprana de este sistema feedforward se basó en preparaciones in vitro donde no se mantuvo la conectividad y la actividad endógena del circuito neuronal28,30,31,32,33,34,35. Este protocolo describe un acercamiento a preservar un circuito de los nervios intacto donde la dinámica endógena de la regeneración se mantiene así permitiendo una mejor comprensión de la descarga del corolario in vivo.
El protocolo descrito aquí describe cómo monitorear la actividad de la neurona aferente de la línea lateral posterior y la neurona motora simultáneamente en el pez cebra larval. La caracterización de la dinámica de señales aferentes antes, durante y después de los comandos motores proporciona información sobre la retroalimentación endógena en tiempo real del sistema nervioso central que modula la sensibilidad de las células ciliadas durante la locomoción. Este protocolo describe qué materiales deberán prepararse antes de los experimentos y luego describe cómo paralizar y preparar las larvas de pez cebra. El protocolo describirá cómo establecer un registro de parches sueltos estables de neuronas aferentes y grabaciones de raíz ventral extracelular (VR) de neuronas motoras. Los datos representativos que se pueden obtener utilizando este protocolo se presentan a partir de un individuo ejemplar y el análisis se realizó en múltiples réplicas del protocolo experimental. El preprocesamiento de datos se realiza utilizando scripts escritos personalizados en MATLAB. En general, este paradigma experimental in vivo está preparado para proporcionar una mejor comprensión de la retroalimentación sensorial durante la locomoción en un sistema modelo de células ciliadas de vertebrados.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo experimental descrito proporciona el potencial para monitorear los cambios endógenos en la entrada sensorial a través de los comportamientos motores en un vertebrado intacto y comportándose. Específicamente, detalla un enfoque in vivo para realizar grabaciones extracelulares simultáneas de neuronas aferentes de línea lateral y raíces motoras ventrales en larvas de pez cebra. La actividad aferente espontánea se ha caracterizado previamente en el pez cebra sin tener en cuenta la potencial actividad mot…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo del Instituto Nacional de Salud (DC010809), la Fundación Nacional de Ciencias (IOS1257150, 1856237) y el Laboratorio Whitney de Biociencias Marinas a J.C.L. Nos gustaría agradecer a los miembros pasados y presentes del Laboratorio Liao por estimular las discusiones.
Materials
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
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