Diferentes neurônios de sistemas de mecanosensoria transmitem informações das células ciliares para o cérebro durante a audição e equilíbrio. A eletrofisiologia pode revelar a sensibilidade de neurônios diferentes através de gravações diretas. Embora a remenda celular inteira das células ciliares possa ser desafiadora, o registro a partir de neurônios a montante é mais fácil e permite a avaliação dos potenciais de ação em resposta às estimulações controladas^1,2,3. Estimular as células ciliadas leva à sua deflexão, o que modifica estruturas mecanosensoriais, desencadeando assim um aumento nos potenciais de ação (picos) em neurônios diferentes^4,5,6. Na ausência de estímulos externos, os neurônios aferentes também aumentam espontaneamente devido ao vazamento de glutamato das células ciliadas nos diferentes terminais pós-sinápticos^7,8, e têm se mostrado contribuintes para a manutenção da sensibilidade^9,10. O registro do grampo de correção da atividade aferente permite a observação da sensibilidade das células ciliares e da dinâmica do sinal que não são possíveis utilizando técnicas com menor resolução temporal, como na microfônica^11,12 ou imagem funcional de cálcio^13,14,15. O protocolo a seguir permitirá o registro de atividades diferentes concomitantemente com comandos motores para revelar alterações instantâneas na sensibilidade das células ciliares.

Os zebrafish (Danio rerio) utilizam células ciliares contidas em neuromasses que compõem o sistema de linha lateral para detectar o movimento da água em relação ao seu corpo, o que é traduzido em sinais neurais essenciais para a navegação^16,17,18, prevenção de predadores, captura de presas^19,20, e escolaridade²¹. O fluxo de água também pode ser autogerado pelos movimentos da natação^22,23,24, respiração^22,25,26e alimentação²⁷. Esses comportamentos compreendem movimentos repetitivos que podem fadigar as células ciliares e prejudicar a detecção. Portanto, é fundamental que o sistema de linha lateral diferencie entre estímulos de fluxo externos (exafentes) e autogerado (reafeto). Uma descarga corolária atenua sinais de fluxo autogerados durante a locomoção em zebrafish. Este sinal motor preditivo inibidor é retransmitido através de neurônios descendentes para os receptores sensoriais para modificar a entrada ou interromper o processamento do feedback reafesso^28,29. O trabalho seminal que contribuiu para a nossa compreensão inicial deste sistema de alimentação contou com preparações in vitro onde a conectividade e a atividade endógena do circuito neural não foram mantidas^{28,30,31,32,33,34,35}. Este protocolo descreve uma abordagem para preservar um circuito neural intacto onde a dinâmica de feedback endógeno é mantida, permitindo assim uma melhor compreensão da descarga corolária in vivo.

O protocolo aqui descrito descreve como monitorar a linha lateral posterior a atividade de neurônios e neurônios motores simultaneamente em zebrafish larval. Caracterizar uma dinâmica de sinal diferente antes, durante e depois dos comandos motores, fornece insights sobre o feedback endógeno em tempo real do sistema nervoso central que modula a sensibilidade das células ciliares durante a locomoção. Este protocolo descreve quais materiais precisarão ser preparados antes dos experimentos e, em seguida, descreve como paralisar e preparar larvas de zebrafish. O protocolo descreverá como estabelecer uma gravação de remendo solto estável de neurônios aferentes e gravações de raiz ventral extracelular (VR) de neurônios motores. Os dados representativos que podem ser obtidos por meio deste protocolo são apresentados a partir de um indivíduo exemplar e a análise foi realizada em múltiplas réplicas do protocolo experimental. O pré-processamento de dados é realizado usando scripts escritos personalizados no MATLAB. No geral, esse paradigma experimental in vivo está pronto para proporcionar uma melhor compreensão do feedback sensorial durante a locomoção em um modelo de sistema de células ciliadas vertebradas.