Summary

얼룩말피에서 수영하는 동안 후방 측면 라인 발신 신경의 활동

Published: February 10, 2021
doi:

Summary

우리는 모델 척추 동물 머리 세포 시스템에서 모터 명령 중 발포성 뉴런 활동의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

감각 시스템은 행동을 지시하는 데 필수적인 단서를 수집하지만 동물은 생물학적으로 관련된 정보를 해독해야합니다. 운동운동은 동물이 주변 환경의 관련 감각 단서에서 벗어나야 한다는 재흡수성 단서를 생성합니다. 예를 들어, 물고기가 수영할 때, 신체 기복으로부터 생성된 흐름은 모발 세포를 포함하는 기계광 신경종에 의해 검출되어 측면 선 시스템을 구성한다. 모발 세포는 감각 발포성 뉴런을 통해 센서에서 뇌로 유체 운동 정보를 전송합니다. 동시에, 모터 명령의 동시 방전은 감각 과부하를 방지하기 위해 모발 세포에 릴레이된다. 운동 중 예측 모터 신호의 억제 효과를 고려하므로 측면 선 시스템의 감도를 평가할 때 매우 중요합니다. 우리는 몇 시간 동안 지속될 수 있는 제브라피시 애벌레(4-7일 후 수정)에서 후방 측면선 발포성 뉴런 및 복부 모터 루트 활성을 동시에 모니터링하는 생체 내 전기생리학적 접근법을 개발했습니다. 포이발성 뉴런의 세포외 기록은 단일 또는 다중 뉴런에서 활동을 감지할 수 있는 느슨한 패치 클램프 기술을 사용하여 달성됩니다. 복부 뿌리 기록은 모터 뉴런 활동을 검출하기 위해 유리 전극으로 피부를 통해 수행됩니다. 당사의 실험 프로토콜은 척추동물과 동작하는 그대로 모터 동작에 걸쳐 내인성 또는 유발된 감각 입력의 변화를 모니터링할 수 있는 잠재력을 제공합니다.

Introduction

메카노 감각 시스템의 발포성 뉴런은 청력과 균형 동안 모발 세포에서 뇌로 정보를 전송합니다. 전기 생리학은 직접 기록을 통해 포성 뉴런의 감도를 나타낼 수 있습니다. 모발 세포에서 전체 세포 패치는 어려울 수 있지만, 다운스트림 포성 뉴런에서 기록하는 것은 더 쉬우며 제어 자극1,2,3에대한 응답으로 작용 잠재력의 평가를 할 수 있습니다. 자극하는 모발 세포는 메카노감각 구조를 수정하는 편향으로 이어지므로 포근성 뉴런4,5,6에서작용 잠재력(스파이크)의 증가를 유발한다. 외부 자극이 없는 경우, 발포성 뉴런은 모발 세포로부터 발구성 시냅스 후 단자7,8로글루타민트 누출로 인해 자발적으로 스파이크하고, 감도9,10을유지하는 데 기여하는 것으로 나타났다. 포어런트 활성의 패치 클램프 레코딩을 사용하면 미세포닉스11,12 또는 기능성 칼슘 이미징13,14,15와같이 낮은 측두해상도기술을 사용하여 사용할 수 없는 모발 세포 민감도 및 신호 역학을 관찰할 수 있다. 다음 프로토콜은 모터 명령과 동시 적으로 발포성 활동의 기록을 통해 모발 세포 민감도의 즉각적인 변화를 나타낼 수 있게 합니다.

Zebrafish(Danio rerio)는항비16,17,18,육식 동물 회피, 먹이 포착19,20및 학교21에필수적인 신경 신호로 변환되는 신체에 비해 물 움직임을 감지하기 위해 측면 라인 시스템을 구성하는 신경 종에 함유 된 모발 세포를 사용합니다. 또한수영22,23,24,호흡22,25,26,수유(27)의 움직임에 의해 수유를 자체 생성할 수 있다. 이러한 동작은 모발 세포를 피로하고 감지를 손상시킬 수 있는 반복적인 움직임을 포함합니다. 따라서 측면 선 시스템은 외부(exafferent)와 자체 생성(reafferent) 흐름 자극을 구별하는 것이 중요합니다. 모조부에서 운동하는 동안 자체 생성 된 흐름 신호를 감쇠하는 계수 방전. 이러한 억제 예측 모터 신호는 내림내뉴런을 통해 감각 수용체로 중계되어 입력을 수정하거나 재흡수피드백(28,29)의처리를 방해한다. 이 이송형 시스템의 초기 이해에 기여하는 정액 작업은 신경 회로의 연결및 내인성 활동이 유지되지 않은 시험관 내 제제에 의존하여28,30,31,32,33,34, 35. 이 프로토콜은 내인성 피드백 역학이 유지되므로 생체 내 의 계수 방전을 더 잘 이해할 수 있도록 유지되는 온전한 신경 회로를 보존하는 방법을 설명합니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 후반면 라인 발포성 뉴런과 운동 신경 활동을 동시에 애벌레 얼룩말피에서 모니터링하는 방법을 설명합니다. 운동 명령 전, 도중 및 운동 후 발포성 신호 역학을 특성화하면 운동 중에 모발 세포 민감도를 조절하는 중추 신경계의 실시간 내인성 피드백에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험 전에 준비해야 할 물질을 설명하고 제브라피시 애벌레를 마비시키고 준비하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 운동 뉴런의 포근 과 세포 외 복부 루트 (VR) 기록의 안정적인 느슨한 패치 기록을 설정하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻을 수 있는 대표적인 데이터는 모범적인 개인으로부터 제시되고 실험 프로토콜의 여러 복제에 대한 분석이 수행되었다. 데이터의 사전 처리는 MATLAB의 사용자 지정 서면 스크립트를 사용하여 수행됩니다. 전반적으로, 생체 내 실험 패러다임은 모델 척추동물 모발 세포 시스템에서 운동 중 감각 피드백에 대한 더 나은 이해를 제공할 태세입니다.

Protocol

모든 동물 관리 및 실험은 플로리다 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 1. 전기 생리적 기록을 위한 재료 준비 실리콘 엘라스토머 바닥 녹음 접시를 만드십시오. 실리콘 엘라스토머 성분(예: 실가드)을 커버 글래스 바닥 조직 배양 접시에 분배하여 얕은 우물의 테두리와 함께 레벨을 넘습니다. 약 0.5 mL이 충분합니?…

Representative Results

제브라피시 애벌레가 제대로 고정되고 후방 측면선 포렌트 신경절및 VR 레코딩이 달성된 후, 포퍼런트 및 모터 뉴런 모두에서의 활동을 동시에 측정할 수 있다. 녹화 채널은 비응성 및 VR 활동을 지속적으로 모니터링하기 위해 간격이 없는 레코딩 프로토콜(단계 1.4)을 사용하여 표시됩니다. 실시간으로, 자발적인 포성 스파이크 속도의 감소는 가상의 수영 시합을 나타내는 VR 활동과 동시 관찰될 수…

Discussion

설명된 실험 프로토콜은 척추동물과 동작하는 그대로 모터 거동에 걸쳐 감각 입력의 내인성 변화를 모니터링할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 특히, 유충 제브라피시의 측면 선 포성 뉴런과 복부 모터 뿌리의 동시 세포 외 레코딩을 수행하는 생체 내 접근법을 자세히 설명합니다. 자발적인 발포활성은 이전에 잠재적 동시모터활동1,2,<su…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

국립보건원(DC010809), 국립과학재단(IOS1257150, 1856237), 휘트니 해양생물과학연구소의 지원을 J.C.L에 감사드립니다. 랴오랩의 과거와 현 멤버들에게 토론을 자극해 주신 것에 대해 감사드립니다.

Materials

100 mL beaker PYREX 1000 resceptacle for etchant
10x water immersion objective Olympus UMPLFLN10xW low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective Olympus LUMPLFLN40XW higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m supplemental coding file custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m supplemental coding file custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables ThorLabs 2249-C-12 connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament Warner Instruments G150F-3 inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer N/A N/A any computer should work
DC Power Supply Tenma 72-420 used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Axon DigiData 1440A enables acquisition of patch-clamp data
filament Sutter Instrument Company FB255B 2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope Olympus BX51WI microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip Fisher Scientific 02-707-169 flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish World Precision Instruments Inc. FD3510-100 cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe KimTech 34155 task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard World Precision Instruments Inc. 710172 self-mixing sylgard elastomer
MATLAB MathWorks R2020b command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier Axon Instruments, Molecular Devices MultiClamp 700B patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge Narishige MF-830 microforge to polish recording electrode
micromanipulator control unit Siskiyou MC1000-eR/T 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97 for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit Siskiyou MC1000e positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator Siskiyou MX7600 positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander Molecular Devices 2.2.2 downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table Newport Corporation VH3036W-OPT breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP Molecular Devices 10.7.0 downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker Sharpie order from amazon.com for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish Falcon 35-3001 used to immerse larvae in paralytic
pipette holder Molecular Devices 1-HL-U hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer Fluke Biomedical Instruments DPM1B for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473-25G etchant for etching dissection pins
silicone tubing Tygon 14-169-1A tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000-C used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade Canopus order from amazon.com cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe Becton Dickinson Compoany 309602 filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette Sigma-Aldrich Z135003-500EA single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate Syndel 12854 pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire World Precision Instruments Inc. 715500 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit Sigma-Aldrich SCGVU11RE single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage Molecular Devices CV-7B supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin ThermoFisher B1601 for immobilizing the larvae prior to recording

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Diesen Artikel zitieren
Lunsford, E. T., Liao, J. C. Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish. J. Vis. Exp. (168), e62233, doi:10.3791/62233 (2021).

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