Attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto in Zebrafish
Summary
Descriviamo un protocollo per monitorare i cambiamenti nell’attività dei neuroni afferenti durante i comandi motori in un modello di sistema di cellule ciere vertebrate.
Abstract
I sistemi sensoriali raccolgono segnali essenziali per dirigere il comportamento, ma gli animali devono decifrare quali informazioni sono biologicamente rilevanti. La locomozione genera segnali di disafferente che gli animali devono districare dai segnali sensoriali rilevanti dell’ambiente circostante. Ad esempio, quando un pesce nuota, il flusso generato dalle ondulazioni del corpo viene rilevato dai neurositi meccanorecettivi, che comprendono cellule ciliate, che compongono il sistema di linee laterale. Le cellule ciliate trasmettono quindi informazioni sul movimento del fluido dal sensore al cervello attraverso i neuroni afferenti sensoriali. Contemporaneamente, la scarica corollare del comando motorio viene trasmessa alle cellule ciliate per evitare sovraccarichi sensoriali. La contabilizzazione dell’effetto inibitorio dei segnali motori predittivi durante la locomozione è, quindi, fondamentale quando si valuta la sensibilità del sistema di linee laterale. Abbiamo sviluppato un approccio elettrofisiologico in vivo per monitorare contemporaneamente l’attività del neurone afverso della linea laterale posteriore e della radice motoria ventrale nelle larve di zebrafish (4-7 giorni dopo la fecondazione) che può durare diverse ore. Le registrazioni extracellulari dei neuroni afferenti si ottengono utilizzando la tecnica del patch clamp sciolto, che può rilevare l’attività da singoli o più neuroni. Le registrazioni delle radici ventrali vengono eseguite attraverso la pelle con elettrodi di vetro per rilevare l’attività dei motoneuroni. Il nostro protocollo sperimentale offre il potenziale per monitorare i cambiamenti endogeni o evocati nell’input sensoriale attraverso i comportamenti motori in un vertebrato intatto e comportamentale.
Introduction
Neuroni afferenti di sistemi meccanosensoriali trasmettono informazioni dalle cellule ciliate al cervello durante l’udito e l’equilibrio. L’elettrofisiologia può rivelare la sensibilità dei neuroni afferenti attraverso registrazioni dirette. Mentre l’applicazione di patch a cellule intere dalle cellule ciliate può essere impegnativa, la registrazione da neuroni a valle è più semplice e consente la valutazione dei potenziali d’azione in risposta allestimolazioni controllate 1,2,3. Stimolare le cellule ciliate porta alla loro deflessione, che modifica le strutture meccanicosensoriali, innescando così un aumento dei potenziali d’azione (picchi) nei neuroni afferenti4,5,6. In assenza di stimoli esterni, anche i neuroni afenti aumentano spontaneamente a causa della perdita di glutammato dalle cellule ciliate ai terminali post-sinaptici afetti7,8e hanno dimostrato di contribuire a mantenere lasensibilità 9,10. La registrazione del morsetto patch dell’attività afosa consente l’osservazione della sensibilità delle cellule cilieche e della dinamica del segnale che non sono possibili utilizzando tecniche con risoluzione temporale inferiore, come nella microfotica11,12 o nell’imaging funzionaledel calcio 13,14,15. Il seguente protocollo consentirà la registrazione di attività diverse in concomitanza con i comandi motori per rivelare cambiamenti istantanei nella sensibilità delle cellule ciecarie.
I pesci zebra (Danio rerio) utilizzano cellule ciliate contenute in neurosumache che compongono il sistema di linee laterale per rilevare il movimento dell’acqua rispetto al loro corpo, che si traduce in segnali neurali essenzialiper la navigazione 16,17,18,l’elusione dei predatori, la cattura delle prede19,20e lascolarizzazione 21. Il flusso d’acqua può anche essere autogenerato dai movimentidel nuoto 22,23,24,respirazione 22,25,26e alimentazione27. Questi comportamenti comprendono movimenti ripetitivi che possono affaticare le cellule ciliate e compromettere il rilevamento. Pertanto, è fondamentale che il sistema di linee laterale distingua tra stimoli di flusso esterni (esafferenti) e autogenerati (reafferenti). Una scarica corollare attenua i segnali di flusso autogenerati durante la locomozione nei pesci zebra. Questo segnale motore predittivo inibitorio viene trasmesso tramite neuroni discendenti ai recettori sensoriali per modificare l’ingresso o interrompere l’elaborazione del feedback reafferente28,29. Il lavoro seminale che ha contribuito alla nostra comprensione precoce di questo sistema feedforward si è basato su preparati in vitro in cui la connettività e l’attività endogena del circuito neuralenon sono state mantenute 28,30,31,32,33,34,35. Questo protocollo descrive un approccio alla conservazione di un circuito neurale intatto in cui vengono mantenute dinamiche di feedback endogene consentendo così una migliore comprensione della scarica corollare in vivo.
Il protocollo qui delineato descrive come monitorare l’attività del neurone afferente della linea laterale posteriore e del motoneurone contemporaneamente nel pesce zebra larvale. Caratterizzare la dinamica del segnale afferente prima, durante e dopo i comandi motori fornisce informazioni sul feedback endogeno in tempo reale del sistema nervoso centrale che modula la sensibilità delle cellule ciere durante la locomozione. Questo protocollo delinea quali materiali dovranno essere preparati prima degli esperimenti e quindi descrive come paralizzare e preparare le larve di zebrafish. Il protocollo descriverà come stabilire una registrazione stabile delle patch sciolte dei neuroni afferenti e delle registrazioni di radici ventrali extracellulari (VR) dei motoneuroni. I dati rappresentativi che possono essere ottenuti utilizzando questo protocollo sono presentati da un individuo esemplare e l’analisi è stata eseguita su più repliche del protocollo sperimentale. La pre-elaborazione dei dati viene eseguita utilizzando script scritti personalizzati in MATLAB. Nel complesso, questo paradigma sperimentale in vivo è pronto a fornire una migliore comprensione del feedback sensoriale durante la locomozione in un sistema di cellule ciere vertebrate modello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo sperimentale descritto fornisce il potenziale per monitorare i cambiamenti endogeni nell’input sensoriale attraverso i comportamenti motori in un vertebrato intatto e si comporta. In particolare, descrive in dettaglio un approccio in vivo all’esecuzione simultanea di registrazioni extracellulari di neuroni afferenti a linea laterale e radici motorie ventrali nel pesce zebra larvale. L’attività spontanea efferente è stata precedentemente caratterizzata nel pesce zebra senza considerare la potenziale attivi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo con gratitudine il sostegno del National Institute of Health (DC010809), della National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) e del Whitney Laboratory for Marine Biosciences di J.C.L. Ringraziamo i membri passati e presenti del Liao Lab per aver stimolato le discussioni.
Materials
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
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