जेब्राफिश में तैराकी के दौरान पीछे की पार्श्व रेखा Afferent न्यूरॉन्स की गतिविधि
Summary
हम एक मॉडल कशेरुकी बाल सेल प्रणाली में मोटर कमांड के दौरान afferent न्यूरॉन गतिविधि में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन।
Abstract
संवेदी प्रणाली व्यवहार निर्देशन के लिए आवश्यक संकेत इकट्ठा, लेकिन जानवरों को समझना चाहिए कि क्या जानकारी जैविक रूप से प्रासंगिक है । लोकोमोशन रफ़ू संकेत उत्पन्न करता है कि जानवरों को आसपास के वातावरण के प्रासंगिक संवेदी संकेतों से अलग होना चाहिए। उदाहरण के लिए, जब कोई मछली तैरती है, तो शरीर के लहरों से उत्पन्न प्रवाह का पता मेकेनोरेसेप्टिव न्यूरोमाट्स द्वारा लगाया जाता है, जिसमें बाल कोशिकाएं शामिल होती हैं, जो पार्श्व रेखा प्रणाली की रचना करती हैं। बाल कोशिकाओं तो संवेदी afferent न्यूरॉन्स के माध्यम से मस्तिष्क को सेंसर से तरल पदार्थ गति जानकारी संचारित । समवर्ती, मोटर कमांड के परिणामी निर्वहन संवेदी अधिभार को रोकने के लिए बाल कोशिकाओं को रिले किया जाता है। लोकोमोशन के दौरान भविष्य कहनेवाला मोटर संकेतों के निरोधात्मक प्रभाव के लिए लेखांकन, इसलिए, पार्श्व लाइन प्रणाली की संवेदनशीलता का मूल्यांकन करते समय महत्वपूर्ण है। हमने वीवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण विकसित किया है ताकि एक साथ जेब्राफिश लार्वा (4-7 दिन बाद निषेचन) में पीछे की पार्श्व रेखा afferent न्यूरॉन और वेंट्रल मोटर रूट गतिविधि की निगरानी की जा सके जो कई घंटों तक चलेगा। ढीले पैच क्लैंप तकनीक का उपयोग करके अफरेंट न्यूरॉन्स की बाह्य एकल रिकॉर्डिंग प्राप्त की जाती है, जो एकल या कई न्यूरॉन्स से गतिविधि का पता लगा सकती है। मोटर न्यूरॉन गतिविधि का पता लगाने के लिए ग्लास इलेक्ट्रोड के साथ त्वचा के माध्यम से वेंट्रल रूट रिकॉर्डिंग की जाती है। हमारा प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल एक अक्षुण्ण, व्यवहार कशेरुकी में मोटर व्यवहार में संवेदी इनपुट में अंतर्जात या पैदा परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता प्रदान करता है।
Introduction
मशीनोसेंसरी सिस्टम के एफेरेंट न्यूरॉन्स श्रवण और संतुलन के दौरान बालों की कोशिकाओं से मस्तिष्क को जानकारी प्रसारित करते हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डायरेक्ट रिकॉर्डिंग के जरिए एफेरेंट न्यूरॉन्स की संवेदनशीलता को उजागर कर सकती है। जबकि बालों की कोशिकाओं से पूरी कोशिका पैचिंग चुनौतीपूर्ण हो सकती है, डाउनस्ट्रीम अफ़रेंट न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग करना आसान है और नियंत्रित उत्तेजनाओं के जवाब में कार्रवाई क्षमताओं के आकलन की अनुमति देता है1,2,3। उत्तेजक बाल कोशिकाओं को उनके विक्षेप की ओर ले जाते हैं, जो मशीनी संरचनाओं को संशोधित करता है, इस प्रकार अफ़ोड़क न्यूरॉन्स4,5,6में एक्शन क्षमता (स्पाइक्स) में वृद्धि को ट्रिगर करता है। बाहरी उत्तेजनाओं के अभाव में, अफरेंट न्यूरॉन्स भी अनायास बाल कोशिकाओं से ग्लूटामेट रिसावके कारण7, 8के बाद के अफरेंट पोस्ट-सिनैप्टिक टर्मिनलों पर स्पाइक करते हैं, और संवेदनशीलता9,10को बनाए रखने की दिशा में योगदान करने के लिए दिखाए गए हैं। अफ़रीद गतिविधि की पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग बाल कोशिका संवेदनशीलता और सिग्नल गतिशीलता का अवलोकन करने में सक्षम बनाती है जो कम लौकिक संकल्प के साथ तकनीकों का उपयोग करना संभव नहीं है, जैसे माइक्रोफोनिक्स11,12 या कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग13,14,15में। निम्नलिखित प्रोटोकॉल बाल कोशिका संवेदनशीलता में तात्कालिक परिवर्तन प्रकट करने के लिए मोटर आदेशों के साथ विषम गतिविधि समवर्ती की रिकॉर्डिंग की अनुमति देगा।
जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)न्यूरोमाट्स में निहित बाल कोशिकाओं का उपयोग करते हैं जो उनके शरीर के सापेक्ष पानी के आंदोलन का पता लगाने के लिए पार्श्व रेखा प्रणाली की रचना करते हैं, जिसका अनुवाद नौवहन16,17, 18,शिकारी परिहार, शिकार कैप्चर19,20और स्कूली शिक्षा21के लिए आवश्यक तंत्रिका संकेतों में किया जाता है। 22 , 23 , 24 ,श्वसन 22,25,26और भोजन27की गति से भी जल प्रवाह स्वयं उत्पन्न हो सकता है । इन व्यवहारों में दोहराव वाले आंदोलन शामिल हैं जो बालों की कोशिकाओं को थकान और संवेदन को ख़राब कर सकते हैं। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि पार्श्व रेखा प्रणाली बाहरी (बाहरी) और स्व-उत्पन्न (रीपरेंट) प्रवाह उत्तेजनाओं के बीच अंतर करती है। एक कोरोलरी डिस्चार्ज जेब्राफिश में लोकोमोशन के दौरान स्व-जनित प्रवाह संकेतों को क्षीण करता है। इस निरोधात्मक भविष्य कहनेवाला मोटर सिग्नल को इनपुट को संशोधित करने या रीपरेंट फीडबैक28 , 29के प्रसंस्करण में बाधा डालने के लिए संवेदी रिसेप्टर्स के लिए उतरते न्यूरॉन्स के माध्यम से रिले कियाजाताहै । इस फीडफॉरवर्ड सिस्टम को हमारी शुरुआती समझ में योगदान देने वाले मौलिक कार्य ने विट्रो की तैयारियों पर भरोसा किया जहां तंत्रिका सर्किट की कनेक्टिविटी और अंतर्जात गतिविधि को28, 30,32,32,34,34,35नहींरखा गया था । यह प्रोटोकॉल एक अक्षुण्ण तंत्रिका सर्किट को संरक्षित करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है जहां अंतर्जात प्रतिक्रिया गतिशीलता को बनाए रखा जाता है जिससे वीवो में कोरोलरी डिस्चार्ज की बेहतर समझ हो जाती है।
यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल में लार्वा जेब्राफिश में एक साथ पीछे की पार्श्व रेखा अफरेंट न्यूरॉन और मोटर न्यूरॉन गतिविधि की निगरानी कैसे की जाए, इसका वर्णन किया गया है। मोटर कमांड से पहले, दौरान और बाद में अफ़ोड़क संकेत गतिशीलता की विशेषता, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से वास्तविक समय, अंतर्जात प्रतिक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो लोकोमोशन के दौरान बाल कोशिका संवेदनशीलता को संशोधित करता है। यह प्रोटोकॉल यह रेखांकित करता है कि प्रयोगों से पहले किन सामग्रियों को तैयार करने की आवश्यकता होगी और फिर यह बताता है कि ज़ेब्राफ़िश लार्वा को लकवा कैसे दिया जाए और तैयार किया जाए। प्रोटोकॉल का वर्णन करेगा कि मोटर न्यूरॉन्स की अफरेंट न्यूरॉन्स और एक्सेसेलुलर वेंट्रल रूट (वीआर) रिकॉर्डिंग की एक स्थिर ढीली पैच रिकॉर्डिंग कैसे स्थापित की जाए। प्रतिनिधि डेटा है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है एक आदर्श व्यक्ति से प्रस्तुत कर रहे है और विश्लेषण प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के कई प्रतिकृति पर किया गया था । डेटा की प्री-प्रोसेसिंग मैटलैब में कस्टम लिखित लिपियों का उपयोग करके की जाती है। कुल मिलाकर, वीवो प्रयोगात्मक प्रतिमान में यह एक मॉडल कशेरुकी बाल सेल प्रणाली में लोकोमोशन के दौरान संवेदी प्रतिक्रिया की बेहतर समझ प्रदान करने के लिए तैयार है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रायोगिक प्रोटोकॉल एक अक्षुण्ण, व्यवहार कशेरुकी में मोटर व्यवहार भर में संवेदी इनपुट में अंतर्जात परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता प्रदान करता है । विशेष रूप से, यह लार्वा ज़ेब्राफ़िश में ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञता से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (DC010809), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IOS1257150, 1856237), और समुद्री जैव विज्ञान के लिए व्हिटनी प्रयोगशाला J.C.L. से समर्थन स्वीकार करते हैं । हम चर्चा उत्तेजक के लिए लियाओ लैब के अतीत और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं ।
Materials
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
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