פעילות של נוירונים אפרנט קו לרוחב אחורי במהלך שחייה בזברהפיש
Summary
אנו מתארים פרוטוקול לניטור שינויים בפעילות הנוירונים האדיבים במהלך פקודות מוטוריות במערכת תאי שיער של בעלי חוליות מודל.
Abstract
מערכות חושיות אוספות רמזים החיוניים להכוונת התנהגות, אך בעלי חיים חייבים לפענח איזה מידע רלוונטי ביולוגית. תנועה מייצרת רמזים חוזרים כי בעלי חיים חייבים להתנתק מרמזים חושיים רלוונטיים של הסביבה שמסביב. לדוגמה, כאשר דג שוחה, זרימה הנוצרת מגלי גוף מזוהה על ידי נוירומסטים מכניים, הכוללים תאי שיער, המרכיבים את מערכת הקו לרוחב. תאי השיער מעבירים מידע על תנועת נוזלים מהחיישן למוח דרך תאי העצב החושיים. במקביל, פריקה corollary של הפקודה המוטורית מועברת לתאי השיער כדי למנוע עומס חושי. חשבונאות ההשפעה המעכבת של אותות מנוע חזוי במהלך הקטר הוא, אם כן, קריטי בעת הערכת הרגישות של מערכת הקו לרוחב. פיתחנו גישה אלקטרופיזיולוגית in vivo כדי לפקח בו זמנית על נוירון afferent קו לרוחב אחורי ופעילות שורש מנוע הגחוני בזחלים זברה (4-7 ימים לאחר הפריה) שיכול להימשך מספר שעות. הקלטות חוץ-תאיות של נוירונים afferent מושגות באמצעות טכניקת מהדק תיקון רופף, אשר יכול לזהות פעילות של נוירונים בודדים או מרובים. הקלטות שורש גחוני מבוצעות דרך העור עם אלקטרודות זכוכית כדי לזהות פעילות נוירון מוטורי. הפרוטוקול הניסיוני שלנו מספק את הפוטנציאל לנטר שינויים אנדוגניים או מעוררים בקלט חושי על פני התנהגויות מוטוריות בחולייתן שלם ומתנהג.
Introduction
נוירונים afferent של מערכות mechanosensory להעביר מידע מתאי שיער למוח במהלך שמיעה ואיזון. אלקטרופיזיולוגיה יכולה לחשוף את הרגישות של נוירונים afferent באמצעות הקלטות ישירות. בעוד תיקון תאים שלמים מתאי שיער יכול להיות מאתגר, הקלטה מתאי עצב afferent במורד הזרם קל יותר ומאפשר הערכה של פוטנציאל פעולה בתגובה גירויים מבוקרים1,2,3. מגרה תאי שיער להוביל הסטה שלהם, אשר משנה מבנים mechanosensory, ובכך לעורר עלייה בפוטנציאל הפעולה (קוצים) בתאי עצב אדיש4,5,6. בהיעדר גירויים חיצוניים, נוירונים afferent גם ספייק באופן ספונטני עקב דליפת גלוטמט מתאי השיער על מסופים פוסט סינפטיים afferent7,8, והוכחו לתרום לשמירה על רגישות9,10. הקלטת מלחציים של פעילות afferent מאפשרת תצפית על רגישות לתאי השיער ודינמיקת אותות שאינם אפשריים באמצעות טכניקות ברזולוציה זמנית נמוכה יותר, כגון במיקרופוניקה11,12 או הדמיית סידן תפקודית13,14,15. הפרוטוקול הבא יאפשר הקלטה של פעילות afferent במקביל לפקודות המנוע לחשוף שינויים מיידיים ברגישות לתאי השיער.
דגי זברה(Danio rerio)משתמשים בתאי שיער הכלולים בנוירומסטים המרכיבים את מערכת הקו לרוחב כדי לזהות תנועת מים יחסית לגופם, המתורגמת לאותות עצביים החיוניים לניווט16,17,18, הימנעות טורפים, לכידת טרף19,20, ולימוד21. זרימת מים יכולה להיווצר גם על ידי תנועות של שחייה22,23,24,נשימה 22,25,26, והאכלה27. התנהגויות אלה מהוות תנועות חוזרות ונשנות שיכולות להתעייף מתאי השיער ולפגוע בחישה. לכן, זה קריטי כי מערכת הקו לרוחב מבדיל בין חיצוני (exafferent) ו עצמית שנוצר (reafferent) גירויים זרימה. פריקה קורולית מקלה על אותות זרימה עצמיים במהלך תנועה בזברה. אות מנוע חיזוי מעכב זה מועבר באמצעות נוירונים יורדים לקולטנים החושיים כדי לשנות את הקלט או להפריע לעיבוד המשוב החביב28,29. עבודה מהותית שתרמה להבנתנו המוקדמת את מערכת ההזנה הזו הסתמכה על הכנות במבחנה שבהן הקישוריות והפעילות האנדוגנית של המעגל העצבי לא נשמרו28,30,31,32,33,34,35. פרוטוקול זה מתאר גישה לשימור מעגל עצבי שלם שבו נשמרת דינמיקת משוב אנדוגני ובכך מאפשר הבנה טובה יותר של הפרשות corollary ב vivo.
הפרוטוקול המתואר כאן מתאר כיצד לפקח על הנוירונים האחוריים לרוחב קו פעילות נוירון מוטורי בו זמנית זברה זחל. אפיון דינמיקת האותות לפני, במהלך ואחרי פקודות מוטוריות מספק תובנות לגבי משוב אנדוגני בזמן אמת ממערכת העצבים המרכזית המווסתת את רגישות תאי השיער במהלך התנועה. פרוטוקול זה מתאר אילו חומרים יצטרכו להיות מוכנים לפני הניסויים ולאחר מכן מתאר כיצד לשתק ולהכין זחלי זברה. הפרוטוקול יתאר כיצד להקים הקלטה יציבה של תיקון רופף של נוירונים afferent ואת השורש הגחוני חוץ תאי (VR) הקלטות של נוירונים מוטוריים. נתונים מייצגים שניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה מוצגים מאדם למופת וניתוח בוצע בשכפולים מרובים של הפרוטוקול הניסיוני. עיבוד מראש של נתונים מתבצע באמצעות קבצי Script כתובים מותאמים אישית ב- MATLAB. בסך הכל, פרדיגמה ניסיונית זו in vivo צפויה לספק הבנה טובה יותר של משוב חושי במהלך תנועה במערכת תאי שיער בעלי חוליות מודל.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הניסיוני המתואר מספק את הפוטנציאל לניטור שינויים אנדוגניים בקלט החושי על פני התנהגויות מוטוריות בחולייתן שלם ומתנהג. באופן ספציפי, הוא מפרט גישה in vivo לביצוע הקלטות חוץ תאיות בו זמנית של נוירונים afferent קו לרוחב ושורשים מוטוריים גחוניים בזברה זחל. פעילות ספונטנית מתאפיינת בעבר בז…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בהכרת תודה על תמיכת המכון הלאומי לבריאות (DC010809), הקרן הלאומית למדע (IOS1257150, 1856237), ומעבדת ויטני למדעי המוח הימיים ל J.C.L. ברצוננו להודות לחברי מעבדת ליאו בעבר ובהווה על הדיונים הממריצה.
Materials
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
Referenzen
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
- Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
- Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
- Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish’s lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
- Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
- Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell’s afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
- Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
- Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. . Discharge patterns of single fibers in the cat’s auditory nerve. , (1965).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
- Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
- Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
- Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
- Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
- Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
- McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator’s strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
- Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, 388-398 (2013).
- Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, 175166 (2018).
- Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
- Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
- Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, 190587 (2019).
- Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, 893-899 (1996).
- Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
- Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, 3441-3450 (2005).
- Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
- Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
- Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
- Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
- Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
- Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal’s own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
- Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
- Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
- Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
- Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
- Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
- von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
- Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
- Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).
