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Neurowissenschaften

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Published: May 26, 2021
doi:
10.3791/62155
, ,
1Department of Human Genetics,University of Utah

Summary

Questo protocollo descrive un approccio per l’etichettatura in toto e l’imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell’occhio del pesce zebra. Descriviamo l’etichettatura, l’incorporamento e l’imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l’acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Abstract

La funzione del sistema visivo richiede la creazione di precise strutture di tessuti e organi. Nell’occhio dei vertebrati, i difetti strutturali sono una causa comune di disabilità visiva, ma i meccanismi della morfogenesi oculare sono ancora poco compresi. L’organizzazione di base dell’occhio embrionale è conservata in tutti i vertebrati, quindi l’imaging dal vivo degli embrioni di zebrafish è diventato un potente approccio per osservare direttamente lo sviluppo dell’occhio in tempo reale in condizioni normali e patologiche. I processi cellulari dinamici tra cui movimenti, morfologie, interazioni, divisione e morte possono essere visualizzati nell’embrione. Abbiamo sviluppato metodi per l’etichettatura uniforme delle strutture subcellulari e la microscopia confocale timelapse dello sviluppo precoce degli occhi nel pesce zebra. Questo protocollo delinea il metodo per generare mRNA tappato per iniezione nell’embrione di zebrafish a 1 cellula, montare embrioni allo stadio di vescicola ottica (~ 12 ore dopo la fecondazione, hpf) ed eseguire l’imaging timelapse multidimensionale della morfogenesi della coppa ottica su un microscopio confocale a scansione laser, in modo tale che più set di dati vengano acquisiti sequenzialmente nella stessa sessione di imaging. Tale approccio produce dati che possono essere utilizzati per una varietà di scopi, tra cui il tracciamento delle celle, le misurazioni del volume, il rendering tridimensionale (3D) e la visualizzazione. I nostri approcci ci consentono di individuare i meccanismi cellulari e molecolari che guidano lo sviluppo della coppa ottica, sia in condizioni di tipo selvatico che di mutanti genetici. Questi metodi possono essere impiegati direttamente da altri gruppi o adattati per visualizzare molti aspetti aggiuntivi dello sviluppo dell’occhio di zebrafish.

Introduction

Lo sviluppo dell’occhio dei vertebrati inizia con l’emergere, o evaginazione, delle vescicole ottiche dal neuroepitelio cerebrale prospettico. Le vescicole ottiche subiscono quindi una serie di cambiamenti di forma del tessuto, allungandosi e quindi invaginando per generare la coppa ottica. Nella coppa ottica, la retina neurale e l’epitelio pigmentato retinico, entrambi derivati dal neuroepitelio, avvolgono la lente nascente, che deriva dall’ectoderma di superficie. L’intero processo richiede una complessa serie di movimenti cellulari e tissutali e di segnalazione molecolare, coordinati tra popolazioni di cellule neuroepiteliiali, ectodermiche e mesenchimali. Questi eventi iniziali stabiliscono la struttura di base dell’occhio e le fasi successive dello sviluppo dell’occhio, compresa la formazione dell’iride e della cornea, sono elaborazioni sull’organizzazione precoce. Le interruzioni dello sviluppo precoce degli occhi e della morfogenesi sono alla base di numerose condizioni di disabilità visiva negli esseri umani, tra cui l’anoftalmia, la microftalmia e il coloboma. Sbloccare i meccanismi cellulari e molecolari che governano la morfogenesi della coppa ottica è fondamentale per comprendere ulteriormente lo sviluppo del sistema visivo e le condizioni patologiche che si verificano quando questi processi vanno storci.

La nostra comprensione dello sviluppo e della morfogenesi dell’occhio dei vertebrati è emersa da un’enorme quantità di lavoro che spazia dagli studi istologici classici agli approcci embriologici e genetici in una varietà di organismi modello tra cui topo, pulcino, rana e pesce1,2,3,4,5. Mentre questo corpo di lavoro ha stabilito meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo precoce dell’occhio, storicamente esiste una scarsa comprensione della morfogenesi dell’occhio: l’emergere della sua struttura 3D. La maggior parte di questi risultati proviene dall’imaging di embrioni sezionati in punti temporali discreti. Mentre questo è sufficiente per fornire una visione della morfologia dei tessuti in 2 dimensioni, la morfogenesi è un processo dinamico e 3D. Per determinare come la forma del tessuto cambia in 3 dimensioni nel tempo, come si comportano le singole cellule e come tali comportamenti contribuiscono ai cambiamenti nella forma del tessuto 3D, sono necessari approcci diversi.

Una soluzione per colmare questa significativa lacuna nella conoscenza è l’imaging dal vivo, che consente l’osservazione dinamica di cellule e tessuti in tempo reale mentre l’organo prende forma. Sfortunatamente, questo non è facilmente fattibile in molti organismi modello a causa dei vincoli dello sviluppo embrionale. Ad esempio, gli embrioni di topo e pulcino (che si sviluppano in utero o all’interno di un guscio d’uovo) non sono facilmente accessibili e molti embrioni vivi non sono otticamente trasparenti, causando una significativa dispersione della luce e limitando la profondità a cui le immagini possono essere acquisite. Zebrafish, con sviluppo esterno ed embrioni trasparenti, offrono un’opportunità unica per eseguire l’imaging dal vivo della morfogenesi oculare6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Sono disponibili anche ampie linee transgeniche e mutanti, nonché strumenti per generare nuovi transgenici e mutanti20,21,22,23,24. Inoltre, la morfogenesi della coppa ottica si verifica rapidamente nel pesce zebra, in un arco di tempo di 12 ore (12-24 ore dopo la fecondazione, hpf), rendendo fattibile l’imaging dell’intero processo.

Gli sforzi di imaging dal vivo sono stati accelerati dall’espansione e dall’ottimizzazione della famiglia di proteine fluorescenti, che consentono l’etichettatura vitale geneticamente codificata delle strutture subcellulari, nonché miglioramenti e innovazioni ai metodi di microscopia. Il protocollo qui descritto utilizza la microscopia confocale a scansione laser, piuttosto che altri approcci attuali all’imaging dell’embriogenesi del pesce zebra, tra cui la microscopia confocale a disco rotante, la microscopia a illuminazione piana selettiva (SPIM e le sue varianti) e altri metodi di microscopia più specializzati. Per lo sviluppo dell’occhio di zebrafish, abbiamo scoperto che la microscopia confocale a disco rotante non era sufficiente per l’imaging più profondo nel tessuto. Sebbene SPIM vanti un tempo di imaging estremamente rapido e stia diventando sempre più ampiamente utilizzato, la gestione di set di dati di grandi dimensioni per la visualizzazione e l’analisi rimane una sfida. Al contrario, la microscopia confocale a scansione laser è facilmente accessibile, soprattutto per le persone che non hanno esperienza nell’assemblaggio di hardware ottico. Speriamo che l’ampia disponibilità di microscopia confocale a scansione laser renderà il nostro protocollo utile per molti laboratori.

Qui, descriviamo il nostro metodo per catturare set di dati 4D della morfogenesi della coppa ottica, utilizzando in toto l’etichettatura dell’embrione per membrane e cromatina e un microscopio confocale a scansione laser per l’acquisizione di immagini (schematizzato in Figura 1). Le proteine fluorescenti qui utilizzate (EGFP-CAAX e H2A. F/Z-mCherry) sono stati scelti per fornire l’etichettatura dei tessuti con risoluzione a singola cellula. Utilizziamo set di dati generati con questo protocollo per una varietà di funzioni di analisi e visualizzazione delle immagini. Questo protocollo può essere facilmente adattato se si desiderano altre strutture subcellulari. L’etichettatura della membrana plasmatica è stata selezionata per la visualizzazione della forma cellulare: utilizziamo EGFP-CAAX, in cui gli ultimi 21 amminoacidi di H-ras, che fungono da sequenza del segnale di prenilazione, sono fusi al C-terminus di EGFP13. Altre proteine fluorescenti mirate alla membrana plasmatica (ad esempio, fusione transmembrana o miristoilate) sono suscettibili di funzionare altrettanto bene. Per contrassegnare i nuclei, abbiamo selezionato H2A. F/Z-mCherry, in cui mCherry è fuso con una proteina istone13. Ciò garantisce che la divisione cellulare, compreso l’orientamento mitotico del fuso, sia facilmente visualizzante.

Con qualsiasi approccio di imaging dal vivo, è necessario considerare i compromessi tra l’aumento della velocità di imaging massimizzando il rapporto segnale-rumore, la risoluzione assiale e la conservazione del campione. Abbiamo ottimizzato i nostri metodi per massimizzare la qualità dell’immagine e il numero di embrioni che possono essere ripresi in una singola esecuzione. Spesso, l’obiettivo è quello di immaginare la morfogenesi della coppa ottica in un embrione mutante omozigote, che può essere fenotipicamente indistinguibile dal tipo selvatico all’inizio della morfogenesi della coppa ottica e dalla progenie di un incrocio eterozigote (il 25% degli embrioni sono il genotipo desiderato). Ottimizzando e quindi multiplexando l’acquisizione di immagini, c’è una maggiore probabilità di catturare un set di dati di un embrione mutante omozigote.

La risoluzione temporale, ovvero la frequenza con cui vengono acquisiti i dati del volume (Z-stack), è un aspetto chiave dell’imaging timelapse. A seconda dello scopo di tali set di dati, esistono requisiti diversi per la velocità. Inizialmente questo protocollo è stato sviluppato per il tracciamento manuale delle cellule 4D. Il tracciamento delle singole cellule all’interno di un tessuto uniformemente etichettato richiede una risoluzione temporale abbastanza elevata da fornire la certezza che una singola cellula venga continuamente monitorata nel tempo. Abbiamo scoperto che le pile Z della morfogenesi della coppa ottica del pesce zebra devono essere acquisite almeno ogni 3,1 minuti nell’arco di 12 ore; qui, abbiamo ottimizzato la nostra acquisizione su un microscopio confocale a scansione laser in modo tale da poter acquisire Z-stack di 4-5 embrioni ogni 2,5 minuti.

Stabilire la dimensione Z-step è stato un passo cruciale nell’ottimizzazione del protocollo: per il rendering e la visualizzazione 3D, i dati isotropi sono l’ideale, in cui la dimensione Z-step è uguale alla dimensione pixel XY. In realtà, è estremamente difficile acquisire tali dati timelapse con campioni vivi, dati i vincoli con il tempo di imaging e il fotoscilazione. Pertanto, determinare la dimensione adeguata dello Z-step è importante per le esigenze di rendering e visualizzazione dell’esperimento e, in particolare, quale rapporto voxel X: Y: Z è necessario per massimizzare le informazioni assiali mantenendo la velocità e prevenendo il fotosaguching. Per questo protocollo, il rapporto voxel stabilito era 1:1:3,5 (0,6 μm x 0,6 μm x 2,1 μm Z-step size utilizzando un obiettivo di immersione in acqua a lunga distanza di lavoro 40x). Quando si acquisisce una profondità Z di 130-140 μm, questo produce dati di volume con un’adeguata risoluzione temporale e poco fotoscilindamento.

Come discusso in precedenza, questo protocollo è specifico per l’imaging 4D della morfogenesi della coppa ottica del pesce zebra, utilizzando embrioni in toto etichettati per membrana plasmatica e cromatina e un microscopio confocale a scansione laser. Il protocollo riportato di seguito può essere facilmente adattato per una varietà di esperimenti ed esigenze. In primo luogo, per quanto riguarda le strutture subcellulari, qualsiasi struttura per la quale esiste un marcatore cellulare vivo può essere immagine. Successivamente, sebbene l’attenzione qui sia esclusivamente sulla morfogenesi della coppa ottica, l’imaging timelapse può essere adattato per altre fasi dello sviluppo dell’occhio, ad esempio la neurogenesi25,26,27,28,29,30,31,32,33. Per lo sviluppo successivo dell’imaging, potrebbe essere necessario considerare l’immobilizzazione dell’embrione (poiché l’attività muscolare spontanea inizia intorno a 24 hpf), la pigmentazione (che inizia ad emergere intorno a 24 hpf), le dimensioni del tessuto (l’occhio cresce significativamente in volume durante la neurogenesi) e la velocità di imaging (che dovrebbe essere regolata in base alla velocità del processo di interesse). Tutte queste considerazioni possono essere facilmente gestite. Il protocollo è abbastanza flessibile; oltre ai dettagli del protocollo specifico qui, ci sono principi generali che aiuteranno coloro che sono interessati all’imaging dal vivo altri aspetti dello sviluppo dell’occhio.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui utilizzando il pesce zebra sono coperti dal protocollo animale della dott.à.0. Kristen Kwan, “Meccanismi cellulari e molecolari dello sviluppo del sistema visivo nel pesce zebra”, e approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università dello Utah. 1. Sintesi dell’RNA limitato Generare il modello di DNA per la trascrizione in vitro. Linearizzare il modello di DNA digerendo 10 μg di DNA in 100 μL di volume della miscela di reazione. Una reazione tipica è assemblata come segue: digerire 10 μg di DNA usando 3 μL di enzima e 10 μL di tampone, portare il volume di reazione a 100 μL con acqua.NOTA: un modello tipico per il digest è un vettore pCS2, ad esempio pCS2-EGFP-CAAX o pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry per l’etichettatura della membrana e della cromatina descritta qui. In questo caso, i DNA plasmidici vengono digeriti utilizzando l’enzima NotI. Gli utenti dovrebbero essere cauti nell’attività delle stelle; in questo caso, un enzima ad alta fedeltà è raccomandato e disponibile in commercio. Incubare la reazione a 37 °C durante la notte per garantire che il DNA venga digerito fino al completamento. Pulire il digest di restrizione utilizzando un kit di purificazione PCR seguendo il protocollo del produttore. Eluire il DNA con 30 μL ddH2O. Conservare il DNA linearizzato a -20 °C e utilizzare secondo necessità.NOTA: la quantità di DNA digerito e il volume di eluizione producono circa 0,3 μg/μL; questo è sufficiente per ~ 5 cicli di trascrizione in vitro, ogni round usando ~ 2 μg di DNA come modello. Trascrivono in vitro l’RNA con cappuccio utilizzando un kit di trascrizione in vitro. Per i modelli pCS2 (come descritto qui), utilizzare un kit SP6. Assemblare la reazione di trascrizione in vitro, come segue: Digerire 2 μg di modello di DNA o fino a 6 μL con 2 μL di 10x tampone di reazione, 10 μL di 2x mix di ribonucleotidi e 2 μL di 10x miscela enzimatica. Incubare a 37 °C per 2-4 ore o più (tempi più lunghi porteranno a una maggiore resa). Se lo si desidera, 1 μL di mix enzimatico può essere integrato a metà del periodo di incubazione. Digerire il modello di DNA aggiungendo 1 μL di DNasi priva di RNasi e incubando per 15 minuti a 37 °C. Purificare l’RNA limitato utilizzando un kit di purificazione dell’RNA seguendo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali). Elute con 100 μL di H2O senza RNasi.NOTA: L’aggiunta di β-mercaptoetanolo non è necessaria per questa applicazione. Mentre il metodo descritto in questo protocollo è semplice, i reagenti alternativi possono anche essere utilizzati per purificare l’RNA. Precipitare l’RNA. Aggiungere 10 μL di 3 M di NaOAc senza RNasi e 2,5 volumi (~275 μL) di 100% EtOH senza RNasi ghiacciata all’RNA eluito. Incubare la reazione a -20 °C per 15-30 min. Girare per 15 minuti ad alta velocità a 4 °C per pellettizzare l’RNA.NOTA: Il pellet deve essere visibile contro la parete del tubo. È utile notare come il tubo è allineato nella centrifuga in questa fase, al fine di prevedere dove dovrebbe essere il pellet alla fine della rotazione. Rimuovere EtOH con attenzione con una siringa, facendo attenzione ad evitare il riscaldamento, l’essiccazione eccessiva o lo slodging del pellet. Spese di sospensione del pellet in 20 μL di H2O senza RNasi. Controllare l’RNA per assicurarsi che la sintesi abbia successo. Utilizzare 1 μL per misurare la concentrazione su uno spettrofotometro ed eseguire 0,5 μL su un gel di agarose all’1% per verificare la disponibilità di una o due bande discrete, piuttosto che uno striscio a basso peso molecolare. La resa della reazione di trascrizione in vitro deve essere ~1 μg/μL. Aliquota e immagazzinare l’RNA a -20 °C o -80 °C. L’RNA non viene diluito fino a immediatamente prima delle iniezioni. 2. Microiniezione di embrioni di zebrafish a 1 cellula NOTA: Iniettare 200-300 pg per RNA per ottenere l’espressione ubiquitaria della cromatina e delle membrane cellulari durante la morfogenesi della coppa ottica. Preparare 5-10 μL della diluizione dell’RNA e caricare 2,5-5 μL / ago; pianificare un extra nel caso in cui l’ago si rompa. Preparazioni anticipate per iniezioni. Preparare una parabola per stampo a iniezione per facilitare l’allineamento e l’orientamento degli embrioni a 1 cellula per la microiniezione. Sciogliere il 2% di acarosio in E3 (mezzo embrionale standard) e versare in una capsula di Petri. Far galleggiare con attenzione lo stampo a iniezione (vedi Tabella dei materiali)sulla parte superiore dell’agarose caldo per generare l’impronta degli abbeveratoi nell’agarose mentre si solidifica. Una volta che l’agarose si solidifica, rimuovere lo stampo a iniezione.NOTA: i piatti per stampi a iniezione possono essere utilizzati per diversi mesi; coprire in E3 e conservare a 4 °C quando non in uso. Tirare gli aghi per microiniezione. Tirare i capillari di vetro su un lungo cono per realizzare aghi di microiniezione utilizzando una macchina per estrarre l’ago. Programmare la macchina in modo specifico per il tipo di capillari utilizzati. Per capillari borosilicati 1,0 x 0,78 mm utilizzare il seguente programma: calore = 546 °C, trazione = 130, velocità = 70, tempo = 90 (Figura 2F). Conservare gli aghi in una capsula di Petri e fissarla con argilla modellante.NOTA: La ricetta di trazione varierà, a seconda della macchina e del filamento, e i nuovi filamenti devono sempre essere calibrati. Ogni giro di trazione produce due aghi (Figura 2G); farlo più volte per produrre abbastanza aghi in caso di rotture accidentali ed esperimenti futuri. Diluire l’RNA tappato per iniezione. Diluire sia gli RNA EGFP-CAAX che H2A-mCherry a 200-300 ng/μL utilizzando H2O privo di RNasi e 1 μL di rosso fenolo in un volume totale di 5 μL (la concentrazione finale di rosso fenolico è dello 0,1%). Scorrere la miscela e girare brevemente verso il basso per raccogliere il volume totale. Mantenere l’RNA diluito sul ghiaccio prima dell’iniezione. Iniezione di embrioni a 1 cellula Una volta che il pesce inizia a riprodursi, lasciare ~ 15-20 minuti per assicurarsi che le uova si fecondano. Durante questo periodo, ricaricare l’ago con 2,5-5 μL di diluizione dell’RNA utilizzando le punte di un micro-caricatore P10 e P10. Utilizzando un picoiniettore, calibrare l’ago utilizzando un reticolo oculare (è sufficiente anche un vetrino di calibrazione micrometrico) per misurare il volume della goccia (volume di una sfera = (4/3) * pi * raggio ^ 3). Regolare il tempo e la pressione di iniezione in modo tale che il volume di iniezione sia di 1 nL (Figura 2I). Con una pipetta a rulli/trasferimento, caricare con cura le uova nello stampo a iniezione (Figura 2J). Se utile, utilizzare una pincietta per arrotolare gli embrioni in modo tale che la singola cellula sia visibile, prima o durante l’iniezione. È la preferenza dell’utente utilizzare un micromanipolatore. Iniettare embrioni allo stadio a 1 cellula, prendendo di mira la cellula e non il tuorlo (Figura 2M). Ciò garantirà un’etichettatura uniforme dell’embrione in via di sviluppo. Allevare gli embrioni allo stadio desiderato (prima di 12 hpf, secondo la stadiazione standard34). Gli embrioni iniettati avranno uno sviluppo ritardato, quindi allevarli a una temperatura leggermente più alta (29,0-29,5 ° C) per recuperare il tempo. Durante il pomeriggio, controllare gli embrioni e rimuovere quelli morti per preservare la salute della frizione. 3. Montaggio di embrioni di zebrafish allo stadio di vescicola ottica per l’imaging timelapse Prima del montaggio, preparare l’agarose a bassa fusione all’1,6% in E3. Se si pianificano più esperimenti di imaging, preparare ~ 20 ml di agarose a bassa fusione e conservare a temperatura ambiente. Il giorno del montaggio dell’embrione, scioglierlo per generare un’aliquota fresca (1-5 ml) in un tubo che può essere posizionato in un blocco di calore a 42 °C prima del montaggio. Esaminare gli embrioni per un’iniezione di successo e la luminosità complessiva della fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza prima del montaggio. Un campione ideale avrà una forte fluorescenza EGFP e mCherry e sarà nella fase di sviluppo corretta (Figura 3B – B”). Esaminare gli embrioni utilizzando un microscopio a fluorescenza. Seleziona embrioni che esprimano fortemente sia la fluorescenza EGFP che mCherry per il montaggio. Seleziona embrioni che sono 11 hpf. Il conteggio somites per mettere in scena correttamente gli embrioni34; a 11 hpf ci dovrebbero essere 3 somiti, e da 12 hpf ci sono 6 somiti.NOTA: Montando embrioni prima di 12 hpf (a 11 hpf), i campioni saranno opportunamente messi in scena a 12 hpf quando inizia il timelapse. Embrioni decorionati prima del montaggio. Farlo manualmente con una pinna fine o chimicamente usando la pronasi (2 mg / mL). Con embrioni così giovani, è essenziale che la deconionezione venga eseguita all’interno di un piatto rivestito di agar e che gli embrioni non contattino l’interfaccia aria-acqua. Usando una pipetta a rullo di vetro, aspirare un embrione ed espellere più E3 possibile in modo tale che l’embrione si trovi sulla punta della pipetta Pasteur di vetro. Lascia cadere l’embrione nel tubo di agarose dal blocco di calore. Lasciarlo affondare nell’agarose per qualche secondo, quindi succhiare prima un po’ di agarose e poi l’embrione, facendo in modo che l’embrione rimanga sulla punta della pipetta (Figura 3C – C’). Posizionare un piatto con fondo di vetro per l’imaging sotto un cannocchiale di dissezione. Espellere l’embrione e l’agarose in una goccia di agarose nel piatto con fondo di vetro. Usa la pinna per orientare molto rapidamente, in modo tale che l’embrione sia dorsale verso il basso (parte superiore della testa sul fondo di vetro). Lasciare indurire la goccia di agarose (Figura 3D – D’). Questo passo deve essere fatto rapidamente ma con attenzione, poiché gli embrioni in questa fase sono fragili. Gli embrioni danneggiati non sopravviveranno al processo di imaging timelapse.NOTA: È importante orientare tutti gli embrioni in modo coerente per questo esperimento. Quando si esegue il timelapse, gli embrioni devono adattarsi al campo visivo assegnato, mantenendo uno spazio aggiuntivo in cui la vescicola ottica può crescere. Un orientamento ottimale consiste nell’allineare l’asse anteriore-posteriore di tutti gli embrioni “verticalmente” o lungo le ore 12 e 6 su un quadrante dell’orologio (Figura 3G). Montare tra 10-12 embrioni, che è più del doppio di quelli che verranno ripresi, in modo che i campioni migliori possano essere selezionati una volta valutati sulla confocale (Figura 3E – E’). I campioni saranno valutati per età, uniformità dell’etichettatura fluorescente e precisione dell’orientamento di montaggio. Dopo aver montato gli embrioni, pipettare più agarose per coprire completamente il fondo del piatto, racchiudendo così tutte le goccioline di agarose separate in un unico grande disco di agarose (Figura 3F – F’). Una quantità sufficiente di agarose assicurerà che le singole goccioline embrionali o l’intero disco non si sollevino dal fondo del piatto e galleggino fuori dalla vista. Una volta indurito, sovrapporre l’agarose con E3 per mantenere i campioni idratati per tutta la durata dell’esperimento di imaging timelapse (una preoccupazione a seconda dell’umidità dell’edificio e dell’ambiente).NOTA: La tricaina non è necessaria per questi specifici esperimenti di imaging timelapse, poiché questi embrioni sono sufficientemente giovani; tuttavia, se lo si desidera, e se si lavora con stadi più vecchi di embrioni, la tricaina può essere aggiunta nell’acarosio stesso e sovrapposta nei media. Su carta, disegna una mappa degli embrioni per un facile riferimento durante la configurazione del timelapse. Questo è fondamentale per associare successivamente la posizione al genotipo di ciascun campione. 4. Timelapse confocale a più posizioni con un microscopio confocale a scansione laser NOTA: questo protocollo di imaging timelapse è stato progettato per essere utilizzato con un microscopio confocale a scansione laser dotato del software del produttore (vedere Tabella dei materiali). Questo sistema è dotato di un dispositivo piezoelettrico Z-stage che consente una rapida acquisizione di Z-stack. Le linee laser utilizzate in questo protocollo sono un laser a ioni di argon da 488 nm e un laser DPSS a 561 nm. Il laser a 561 nm è adatto per l’imaging del fluoroforo mCherry: è abbastanza vicino al picco di eccitazione mCherry (587 nm) e ben alimentato. Impostare la confocale. Accendere la confocale e accedere al computer desktop. Installare l’inserto piezo Z-stage (Figura 4B), quindi avviare il software di acquisizione. Nel software in modalità acquisizione, attivare i laser 488 e 561 utilizzando il menu a discesa (Figura 4F). I laser impiegano diversi minuti per riscaldarsi, quindi questo passaggio viene eseguito in anticipo per risparmiare tempo.NOTA: i parametri di acquisizione sono i seguenti: selezionare le caselle Z-stack, Time Seriese Position. Impostare Dimensioni fotogramma su 512 (X) x 384 (Y), Velocità di scansione su 9, Modalità di scansione su bidirezionale, Zoom su 0,7, Foro stenopeico su 60,2 (1,63 unità ariose ~ = sezione 1,6 μm) e Intervallo Z su 2,1 μm. Ciò produrrà una dimensione dell’immagine di 303,6 μm x 227,7 μm e una dimensione dei pixel di 0,59 μm. I laser 488 e 561 devono essere controllati e assegnati alla stessa pista; il campo di rilevamento EGFP è 494-545 nm e il campo di rilevamento mCherry è 598-679 (Figura 4F). Rivestire liberamente il fondo della mozza di vetro con un mezzo di immersione corrispondente all’indice di rifrazione dell’acqua, facendo attenzione ad evitare bolle d’aria (Figura 4C). Selezionare l’obiettivo acqua 40x e applicare una piccola goccia di mezzo di immersione all’obiettivo (Figura 4D). Fissare il piatto con fondo di vetro nell’inserto del palco, applicare E3 per mantenere gli embrioni umidi durante la notte, quindi utilizzare l’argilla modellante per sigillare il coperchio di plastica sopra il piatto (Figura 4E). Alza l’obiettivo di prendere contatto con il piatto. Esamina i campioni e preparati per il timelapse. Passare dalla scheda Acquisizione alla scheda Individua e fare clic sul simbolo della lampadina per attivare la luce trasmessa. Con la luce trasmessa, individuare il primo campione con il joystick: a occhio, prima spostare il campione nel fascio di luce, quindi utilizzare gli oculari al centro e concentrarsi su una vescicola ottica. Tornare alla scheda Acquisizione. Assicurarsi che le caselle Z-stack, Time Seriese Posizioni siano controllate e che i laser siano riscaldati per l’uso. Impostare le dimensioni del fotogramma su 512 (X) x 384 (Y), Velocità di scansione su 9, Modalità di scansione su bidirezionale e impostare Zoom su 0,7. Sotto l’intestazione Canali, inizia assegnando i laser 488 e 561 a Power 2.0 e Gain 550 (questo può essere regolato in seguito). Impostare il foro stenopeico su 60,2 (1,63 unità ariose ~= sezione 1,6 μm). Iniziare la scansione utilizzando il pulsante Continuo. Con la manopola di messa a fuoco fine, posizionare il campione nell’asse Z e posizionare l’asse X-Y nel fotogramma. Interrompere la scansione. Sotto l’intestazione Posizioni, fare clic su Aggiungi per salvare le informazioni XYZ sul primo campione (Figura 4F). Fallo solo per i campioni da timelapsed. Seleziona i campioni per la loro forte fluorescenza e il montaggio ottimale. Passare alla scheda Individua, passare all’esempio successivo e ripetere i passaggi 4.2.5-4.2.6, essendo selettivi sulla scelta dei campioni. Finalizzare le posizioni del campione, assegnare z-range e quindi avviare timelapse. Una volta selezionati tutti i campioni (è possibile visualizzare 4-5 campioni entro l’intervallo di tempo totale di 2,5 minuti) e salvate le posizioni, passare attraverso ciascun campione e regolare la posizione XYZ all’interno del fotogramma di visualizzazione. Evidenziare la prima posizione e fare clic su Spostain . Durante la scansione continua, allineare la vescicola ottica all’interno del telaio. Lasciare ampio spazio nelle regioni anteriore e distale rispetto alla vescicola ottica e al cervello. Quindi, assegnate la prima e l’ultima fetta Z selezionando Imposta prima e Imposta ultima mentre spostate la direzione Z con la manopola di messa a fuoco fine. Mantenere un numero totale di fette di ~ 63, in quanto ciò ospiterà la crescita della tazza ottica. Fornire spazio extra sul lato ventrale della vescicola ottica per consentire spazio per la crescita. Una volta impostate la prima e l’ultima fetta Z, fare clic sul pulsante C per spostarsi al centro dello Z-stack. Regolare la potenza e il guadagno del laser per entrambi i laser; se possibile, mantenere la potenza del laser al di sotto di 5 e utilizzare un guadagno più elevato, se necessario. Interrompere la scansione. Aggiorna le informazioni sulla posizione facendo clic su Aggiorna. Passare alla posizione successiva facendo clic su Posizione 2. Ripetere i passaggi 4.3.1-4.3.3 per ogni posizione assegnata. La potenza e il guadagno del laser devono essere impostati in modo tale che tutti i campioni siano sufficientemente illuminati. Una volta finalizzate le informazioni sulla posizione e le impostazioni laser, assegna le impostazioni Time Series. Sotto l’intestazione Serie temporali, assegnare Intervallo di tempo a 2,5 minuti e Cicli a 300 (Figura 4F). Il numero di cicli viene calcolato in modo tale che il timelapse proceda oltre lo stadio di 24 hpf, quando lo sviluppo della coppa ottica è completo. Per iniziare il timelapse, fare clic su Start. Monitorare il primo ciclo completo: utilizzare un timer per assicurarsi che un ciclo completo (imaging di tutte le posizioni) sia inferiore a 2,5 minuti e verificare che ogni posizione appaia corretta. Il microscopio funziona in modo indipendente durante la notte e non ha bisogno di essere monitorato.NOTA: Sebbene la stanza confocale sia a temperatura controllata, la temperatura ambiente è di 20-25 °C. Con l’apparecchiatura in funzione e la scansione laser, la temperatura sul palco sembra essere più vicina a 28,5 ° C, poiché lo sviluppo embrionale procede a questo ritmo previsto, come valutato visivamente con punti di riferimento morfologici. Con queste impostazioni, il timelapse durerà 12,5 ore. Salvare il file una volta completato il timelapse. Sarà grande (~ 40 GB) e può essere separato in singole posizioni dopo essere stato salvato utilizzando il software di acquisizione.

Representative Results

L’iniezione di RNA fluorescenti consente l’etichettatura subcellulareGli RNA che etichettano la membrana plasmatica e gli istoni della cellula vengono iniettati al fine di catturare le morfologie e i movimenti delle singole cellule che sono alla base della morfogenesi della coppa ottica. La Figura 2 mostra ogni fase del processo di microiniezione di embrioni di zebrafish allo stadio di 1 cellula. In breve, i pesci zebra vengono accoppiati (Figura 2E) e gli embrioni vengono raccolti e caricati nello stampo a iniezione (Figura 2J). Un ago per microiniezione viene riempito (Figura 2H), e gli embrioni vengono iniettati direttamente nella singola cellula (Figura 2K-M), che è necessario per ottenere un’etichettatura uniforme (Figura 2M, Figura 4I-I”’, Film1). Oltre all’etichettatura uniforme, si osserva una fluorescenza robusta e lo sviluppo procede imperturbabile (Figura 3B-B”). Un montaggio efficace è essenziale per l’imaging timelapse OCM da 12a24 hpfPer l’immagine della morfogenesi della coppa ottica, che si verifica per un lungo periodo di tempo, è fondamentale selezionare gli embrioni ideali e posizionare correttamente ciascun campione durante l’incorporamento. La Figura 3 mostra un resoconto dettagliato per il successo del montaggio di embrioni da 11 hpf. Gli embrioni iniettati vengono prima sottoposti a screening per una fluorescenza sufficiente (Figura 3B’,B”,F”,F”’). I singoli embrioni sono immersi nell’agarose (Figura 3C, C’) e montati dorsalmente in una singola goccia di agarose (Figura 3D, D’). Tutti i campioni sono montati in un disco collettivo di agarose (Figura 3E-F’). Quando gli embrioni sono messi in scena correttamente, sufficientemente fluorescenti e adeguatamente montati (Figura 3G), i campioni rimarranno nel fotogramma di imaging durante il timelapse consentendo l’immagine dell’intero organo (Figura 4G-G”,I-I”’, Film1). La mancata realizzazione di uno di questi passaggi comporterà un embrione montato che non è un campione ottimale per l’imaging timelapse. La minima variazione nel grado di rotazione avrà un effetto drammatico sulla direzione della crescita dell’embrione durante il timelapse. Le rotazioni sub-ottimali sono mostrate nella Figura 3, tra cui un embrione che è sovra-ruotato (Figura 3I), che si tradurrà in un timelapse più posteriore, e un embrione che è sotto-ruotato (Figura 3J) in cui si può osservare solo il tessuto più anteriore. Oltre alla corretta rotazione durante il montaggio, i campioni montati rispetto all’orientamento del telaio hanno maggiori probabilità di produrre un timelapse di successo (Figura 4G-G”, I-I”’, Film 1). I campioni ottimali sono quelli che sono orientati verticalmente sul piatto, con l’asse anteriore-posteriore in linea con le ore 12 e 6 su un quadrante dell’orologio (Figura 3G). I campioni sub-ottimali sono quelli che non sono orientati su questo asse, come quelli orizzontali o diagonali (Figura 3H). Questi campioni cresceranno fuori dal frame di imaging man mano che il timelapse procede e non possono essere utilizzati per ulteriori analisi (Figura 4H-H”, J-J”’). Acquisizione di un set di dati timelapse adatto per l’analisi futuraGli embrioni che vengono accuratamente iniettati, sollevati e montati produrranno campioni confocali con immagini di successo. La Figura 4 mostra un campione ottimale per il timelapse: c’è anche fluorescenza e il campione è di 12 hpf. Lo z-stack per l’imaging è assegnato in modo tale che la prima fetta sia solo dorsale alla vescicola ottica, mentre l’ultima fetta lascia diverse fette oltre il confine ventrale della vescicola ottica da 12 hpf (Figura 4G-G”). Questa inclinazione verso il lato ventrale fornisce spazio in eccesso per la crescita dei tessuti nella direzione ventrale. Questi fattori, se soddisfatti, si traducono in un timelapse ottimale (Figura 4I-I”’, Film 1). Un campione sub-ottimale ha fluorescenza a mosaico o fioca, ha già sviluppato oltre 12 hpf (quando la morfogenesi della coppa ottica è in corso), o è posizionato male nello Z-stack o nel telaio XY (Figura 4H-H”). Quando questi criteri non sono soddisfatti, il timelapse non catturerà più l’intero volume 3D del tessuto mentre si sviluppa e non può essere utilizzato per ulteriori analisi (Figura 4J-J”’). Figura 1: Flusso di lavoro dell’imaging 4D timelapse della morfogenesi della coppa ottica zebrafish. (A) Per etichettare fluorescentmente le strutture subcellulari di interesse, sintetizzare gli mRNA con cappuccio appropriato. (B) Microiniettare mRNA(s) in embrioni di zebrafish allo stadio di 1 cellula. (C) Gli embrioni sono montati dorsalmente, o a testa in giù per un microscopio confocale invertito, allo stadio di vescicola ottica, ~ 11 ore dopo la fecondazione o 3 stadi somiti. (D) Più embrioni possono essere ripresi in sequenza durante una singola sessione di imaging timelapse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Guida visiva per la microiniezione di embrioni di zebrafish a 1 cellula. (A) Elementi da includere in un kit di iniezione (in senso orario): scatola di medie dimensioni che può contenere l’intero kit con guanti monouso in nitrile; un piatto contenente aghi per microiniezione; pina di forza; un’aliquota di olio minerale e quadrati tagliati di parafilm; punte di microcarico; RNA diluito su ghiaccio; stampo ad iniezione di acarosio; marcatore; pipetta a rulli/transfer; e pipetta P10. (B) Configurazione della microiniezione: un microscopio di dissezione accanto a un picoiniettore collegato a una fonte esterna di gas compresso. Un pedale e un micromanipolatore sono collegati al pico-iniettore. Il micromanipolatore è dotato di un porta ago e posizionato in posizione sopra lo stadio del microscopio. (C) Uno stampo ad iniezione di acarosio contenente sei file di scanalature con un angolo di 90 gradi su un lato e un angolo di 45 gradi sull’altro lato. (D) Il pannello frontale del pico-iniettore. Il display della pressione legge 7,8 PSI; questo può essere regolato con la manopola etichettata Pinject. Sotto, ci sono pulsanti per attivare manualmente la pressione per iniettare, per cambiare il tempo di iniezione o per cancellare, riempire o tenere il liquido nell’ago. Il tempo di iniezione è impostato su 08 (equivalente a 8 x 10 msec). Un tubo di uscita è collegatoall’uscita P ed è collegato all’ago per iniezione. L’interruttore della sorgente del misuratore di pressione è impostato su Piniettare durante l’impostazione della pressione di iniezione e può essere commutato su Pbalance per regolare la pressione basale applicata all’ago quando non vengono effettuate iniezioni. Il regolatoredi bilanciamento P si trova accanto al regolatore diiniezione P. Il pulsante di accensione è acceso per indicare che la macchina è accesa. (E) I pesci zebra adulti sono accoppiati in piccole vasche di riproduzione che contengono una vasca nidificata con un fondo a rete che separa i pesci adulti dalle uova fecondate e consente una facile raccolta. Il livello dell’acqua viene abbassato per imitare le condizioni di acque poco profonde e i divisori del serbatoio vengono rimossi per avviare il comportamento di accoppiamento. (F) Il pannello frontale dell’estrattore di micropipette (ago): contiene un display che mostra le condizioni specifiche utilizzate per tirare gli aghi. L’impostazione della pressione è P = 500, seguita dall’ultima data e ora in cui il programma è stato modificato, il numero di programma, HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 e TIME = 90. (G) Un capillare di vetro viene inserito nell’estrattore di micropipette (ago) e fissato in posizione. Ogni tirata programmata si traduce in due lunghi aghi affusolati (punte di freccia rosse). (H) La diluizione dell’RNA viene scaricata in un ago; il colorante rosso fenolo permette una facile visualizzazione della soluzione. (I) Dopo aver rotto la punta dell’ago, il bolo di RNA viene misurato utilizzando un reticolo oculare sul cannocchiale di dissezione. Per questo stereomicroscopio, a 30x ingrandimento totale 6 segni hash equivalgono a 1 nL di volume. (J) Le uova fecondate vengono caricate nello stampo ad iniezione di acarosio e distribuite lungo le mangiatoie dello stampo utilizzando una pipetta a rulli. (K) Lo stampo per iniezione contenente embrioni monocellulari viene posizionato al microscopio e gli embrioni vengono iniettati in sequenza. (L) L’ago per iniezione viene inserito in ogni embrione mirato alla singola cellula. (M) Una volta nella cellula, il pedale viene utilizzato per innescare una quantità regolata di pressione e il rilascio di 1 nL di RNA nella cellula dell’embrione (come visualizzato dal rosso fenolo). Barre di scala: I = 0,1 mm; L, M = 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Guida visiva per il montaggio di embrioni per l’imaging. (A) Configurazione del montaggio (da sinistra a destra): un blocco termico programmato a 42 °C, tubi riscaldanti di agarose a bassa fusione; una pipetta a rulli; un paio di pinci; un piatto rivestito di agarose contenente embrioni decorionati; e uno stereomicroscopio sezionante collegato a una lampada fluorescente ad alogenuri metallici. (B,B’,B”) Un embrione di 11 hpf iniettato con mRNA EGFP-CAAX e mRNA mCherry-H2A, mostrati rispettivamente sotto campo luminoso, fluorescenza GFP e fluorescenza mCherry. (C, C’) Una pipetta di vetro pasteur contenente agarose e un embrione seduto nella punta; C’ è una visione ingrandita. (D,D’) Un embrione montato in una goccia di agarose a bassa fusione su un piatto con fondo di vetro, visto sia dallo stadio del microscopio che attraverso gli oculari del microscopio. (E,E’) 12 embrioni montati in singole goccioline di agarose a bassa fusione su un piatto con fondo di vetro, visti sia dallo stadio del microscopio che attraverso gli oculari del microscopio. (F,F’,F”,F”’) Tutti gli embrioni montati sono sovrapposti con uno strato completo di agarose per riempire il fondo del piatto, visto sia dallo stadio del microscopio che dagli oculari del microscopio mostrati in campo luminoso; F” Fluorescenza GFP; e F”’ mCherry fluorescenza. (G) Un campione ottimale a 12 hpf è montato dorsalmente e orientato verticalmente in linea con le ore 12 e 6 con entrambe le vescicole ottiche sullo stesso piano. (H) Un campione sub-ottimale: sebbene le vescicole montate dorsalmente e ottiche siano in piano l’una con l’altra, questo campione è orientato su un asse diagonale e crescerà fuori dalle dimensioni del telaio man mano che lo sviluppo procede. (I) Un campione non ottimale: questo campione è sovra-ruotato e non una montatura dorsale, di conseguenza, la porzione anteriore della vescicola ottica non verrà catturata nel timelapse. (J) Un campione sub-ottimale: questo campione è sotto-ruotato e non una montatura dorsale, di conseguenza la porzione posteriore della vescicola ottica non verrà catturata nel timelapse. Le linee tratteggiate indicano ogni vescicola ottica. Barre di scala: B = 0,1 mm; D’ = 1,5 mm; E’, F’ = 2,5 mm; G = 0,1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Impostazione di un timelapse a più posizioni e potenziali risultati. (Un) Microscopio confocale a scansione laser. (B) Inserto piezoelettrico Z-stage. (C) Il fondo di un piatto con fondo di vetro contenente embrioni incorporati nell’agarose è rivestito in un mezzo di immersione che corrisponde all’indice di rifrazione dell’acqua. (D) Una goccia di mezzo di immersione è posizionata sull’obiettivo 40x W (lunga distanza di lavoro). (E) Il piatto viene tenuto in posizione con l’inserto del palco, E3 viene aggiunto sopra lo strato di agarose e il coperchio è fissato con argilla modellante. (F) Impostazioni del software di acquisizione: le linee laser desiderate vengono attivate dal menu a discesa. Per gli embrioni iniettati con RNA EGFP-CAAX e RNA H2A-mCherry, i laser Argon e DPSS 561-10 sono accesi. L’evidenziazione rossa indica che il laser Argon si sta riscaldando. Per localizzare il campione sopra l’obiettivo, la luce trasmessa viene accesa attraverso il pannello di controllo del microscopio. Sia EGFP che mCherry sono assegnati alla traccia 1 (per l’imaging simultaneo) e viene impostata la portata di ciascun rilevatore. Qui, l’intervallo EGFP è impostato su 494-545 nm e l’intervallo mCherry è impostato su 598-679 nm. Sotto il Canali menu, la potenza del laser può essere impostata. Dopo che i laser si sono riscaldati, la potenza può essere aumentata fino a 5.0 e il guadagno (master) può essere regolato. Il foro stenopeico è impostato su 60,2, che è pari a 1,63 unità ariose o 1,6 μm di sezione. Sotto il Acquisizione , la dimensione del fotogramma è impostata su 512 x 384, la velocità di scansione è 9,0, la media è bidirezionale e lo zoom è impostato su 0,7. Sotto il Z-Stack , la prima e l’ultima posizione nell’asse Z vengono impostate mentre la confocale sta scansionando. L’intervallo (dimensione del passo) è impostato su 2,1 μm. Durante la scelta della prima e dell’ultima posizione Z, viene generalmente mantenuto un numero standard di 63 fette; questo accoglie la crescita complessiva dell’occhio. L’opzione “usa piezo” è selezionata. Sotto il Posizioni , ogni posizione selezionata è elencata includendo un numero assegnato e la posizione X, Y e Z. Ci sono pulsanti aggiuntivi per controllare il numero di embrioni (posizioni separate) da immaginare, tra cui aggiungere, aggiornare o rimuovere. Sotto il Serie temporali , il ciclo è impostato su 300 (il numero di Z-stack che verranno acquisiti) e l’intervallo (passo temporale) è impostato su 2,5 min. Una volta finalizzate le impostazioni, l’acquisizione del timelapse viene avviata premendo start. Il software mostrerà la fetta dello Z-stack, il ciclo e la posizione attualmente in fase di scansione. Al termine del timelapse, il file viene salvato facendo clic sull’icona del disco floppy nella finestra di dialogo Immagini e documenti pannello. (G-J) Membrane cellulari (green) sono etichettati con EGFP-CAAX e nuclei cellulari (cromatina, magenta) sono etichettati con RNA H2A-mCherry. (G,G’,G”) Esempio di impostazione della prima e dell’ultima fetta Z per un campione montato in modo ottimale. La prima fetta di Z (sul lato dorsale) viene a scapito dell’ectoderma dorsale, mentre l’ultima fetta di Z (sul lato ventrale) è ben al di sotto della vescicola ottica, per accogliere la sua crescita nella direzione ventrale. (H,H’,H”) Esempio di impostazione della prima e dell’ultima fetta Z di un campione non ottimale. Il campione ha una debole fluorescenza mCherry ed è montato diagonalmente, in modo tale che è improbabile che la tazza ottica in via di sviluppo rimanga nel frame per la durata del timelapse. (IO,I’,I”,I”’) Esempio di timelapse da un campione ottimale. Le immagini a sezione singola dal centro dello stack Z vengono prese dall’intero volume di 63 sezioni a 4 punti temporali (valore T). Br, cervello; NR, retina neurale; RPE, epitelio pigmentato retinico; Le, lente. (J,J’,J”,J”’) Esempio di timelapse da un campione non ottimale. In questo caso, il campione si è spostato fuori dal piano Z ed è stata catturata solo una porzione obliqua della coppa ottica anteriore. Barre di scala: G, I = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Film 1: Timelapse della morfogenesi della coppa ottica in un embrione wild type ottimale. Una vista dorsale di un embrione di tipo selvatico che è etichettato con EGFP-CAAX (membrane plasmatiche, verde)e H2A. F/Z-mCherry (cromatina, magenta). Il timelapse è da ~ 12-24 hpf e contiene una singola sezione confocale da un intero set di dati 4D. L’intervallo di tempo è di 2,5 minuti tra z-stack e viene mostrato a 22,5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per scaricare questo film.

Discussion

Qui, descriviamo un protocollo per l’etichettatura in toto e l’imaging timelapse 4D della morfogenesi della coppa ottica. Attraversiamo il processo di generazione di RNA limitato che codifica proteine fluorescenti per contrassegnare diversi compartimenti subcellulari; iniettare embrioni di 1 cellula di zebrafish; incorporare embrioni di 11 hpf in agarose per l’imaging multiplexed; e l’acquisizione di set di dati 4D di embrioni multipli per la durata della morfogenesi della coppa ottica (12-24 hpf).

Una miriade di domande può essere risolta con questi set di dati densi di informazioni. I dati 4D possono essere visualizzati e analizzati quantitativamente in vari modi. Sebbene al di fuori dell’ambito di questo protocollo, includiamo qui alcuni dei nostri obiettivi e applicazioni standard come esempio dei tipi di cose che possono essere realizzate. Naturalmente, i metodi di analisi quantitativa delle immagini vengono costantemente sviluppati e possono essere utilizzati sia strumenti disponibili in commercio che personalizzati. Se non si sono mai utilizzati tali metodi in precedenza, si dovrebbe essere pronti a lavorare attraverso una certa ottimizzazione per garantire che i set di dati acquisiti siano adeguati per l’approccio di analisi quantitativa di scelta.

Visualizzare e valutare quantitativamente i set di dati 4D può essere difficile, a causa delle dimensioni dei file. Il software di acquisizione può essere utilizzato per separare i set di dati in singoli embrioni e ImageJ / Fiji può essere utilizzato per convertire file confocali da formati commerciali a pile tif più standard, in cui ogni punto temporale viene salvato come file separato. Ciò ridurrà le dimensioni dei file e standardizzerà i formati di file. Le singole sezioni ottiche di ogni timepoint possono essere assemblate come timelapse 2D (XY) utilizzando ImageJ/Fiji, consentendo una rapida visualizzazione 2D e valutazione dei dati. Il filmato 1 è un esempio proprio di questo: una singola sezione ottica nel tempo assemblata come timelapse del campione ottimale mostrato in Figura 4I–I”’. Da lì, per la visualizzazione 3D e 4D, usiamo comunemente FluoRender35,36, che è disponibile gratuitamente ma ha requisiti specifici della scheda grafica. Utilizzando FluoRender, è possibile ruotare i dati renderizzati in 3D su qualsiasi asse, visualizzare il set di dati in 4D nel tempo, generare ritagli in qualsiasi piano e salvare le rotazioni e le visualizzazioni come un filmato o una serie di immagini tif.

In termini di analisi quantitativa, ci sono numerose domande a cui rispondere. Abbiamo sviluppato software in-house per aiutare i nostri obiettivi specifici di comprensione dei comportamenti cellulari alla base della morfogenesi della coppa ottica. Il nostro programma, LongTracker, utilizza il segnale nucleare come proxy per la posizione per tracciare le cellule13. Con questi dati, possiamo determinare quando, dove e come si muovono le cellule; quanto velocemente e quanto lontano si muovono le cellule; e con quale frequenza le cellule si dividono. Oltre al nostro software, ci sono più opzioni disponibili in commercio e personalizzate per il tracciamento delle celle 4D. Abbiamo anche sviluppato il programma LongAxis per effettuare la segmentazione cellulare e quantificare la forma e l’organizzazione cellulare all’interno della retina neurale37. I set di dati inseriti in LongAxis, tuttavia, sono singoli Z-stack, presi ad alta risoluzione. Una sfida persistente è stata la generazione di set di dati timelapse con una risoluzione abbastanza elevata da consentire alle cellule di essere segmentate con sicurezza e la loro morfologia estrapolata. Un’alternativa è l’etichettatura a mosaico (sparsa) utilizzando un fluoroforo fotoconvertibile come Kaede per la visualizzazione diretta della forma cellulare, come noi e altri abbiamo effettuato nell’occhio in via di sviluppo8,11,13. Ciò semplifica il problema della segmentazione delle celle e la forma e le dimensioni delle celle possono essere facilmente quantificate tramite il rendering 3D in FluoRender.

Ogni fase di questo protocollo è stata ottimizzata specificamente per i nostri scopi. La specificità di questo protocollo comporta diverse limitazioni: il protocollo, come scritto, non è ottimizzato per l’imaging di altri aspetti dello sviluppo dell’occhio di zebrafish (come la neurogenesi retinica), altre strutture oculari, altri stadi di sviluppo o altri compartimenti subcellulari. L’orientamento dell’incorporamento, la velocità di imaging e le etichette sono tutti progettati per permetterci di rispondere alle nostre domande biologiche. Per visualizzare la neurogenesi retinica, ad esempio, l’orientamento dorsale dell’embrione come descritto qui potrebbe non consentire la visualizzazione di specifiche caratteristiche di interesse e la velocità di imaging potrebbe non essere appropriata. Molti aspetti del protocollo possono essere adattati e modificati per una varietà di esigenze, a seconda dei propri interessi e obiettivi specifici. In primo luogo, l’utilizzo di iniezioni di RNA rende il processo di etichettatura molto flessibile. I costrutti di fusione proteica fluorescente possono essere utilizzati per etichettare le strutture subcellulari di interesse e la quantità di iniezione di RNA può essere variata per ottimizzare l’etichettatura. Sulla base del nostro lavoro con il fluoroforo fotoconvertibile Kaede, le iniezioni di RNA sembrano supportare una raffica di traduzione che è finita di 12 hpf11,13. Alti livelli di espressione proteica fluorescente dall’iniezione di RNA potrebbero combattere il fotosbiancamento, ma un tale approccio non supporta l’espressione sostenuta dell’etichetta fluorescente di interesse. Se è necessaria un’espressione sostenuta, ad esempio quando si immaginano embrioni in fasi successive, le linee transgeniche sono un’opzione e la costruzione di nuove linee nel pesce zebra è semplice24.

Successivamente, il protocollo può essere adattato per le fasi successive dello sviluppo. Poiché il pigmento può impedire l’imaging nelle fasi successive, gli embrioni possono essere trattati con feniltiourea (PTU) per inibire la formazione del pigmento, oppure possono essere utilizzati mutanti genetici per la sintesi del pigmento. Per prevenire le contrazioni embrionali, la tricaina può essere aggiunta alle soluzioni di sovrapposizione di agarose e mezzi embrionali e la percentuale di agarose può essere regolata se necessario. Man mano che l’occhio cresce, potrebbe essere necessario modificare l’orientamento di montaggio; qui, montiamo gli embrioni dorsalmente, ma nelle fasi successive, può avere più senso montare lateralmente o anteriormente, a seconda della struttura di interesse. Poiché processi diversi si verificano su diverse scale spaziali e temporali, è anche possibile ottimizzare il passo Z e il passo temporale dell’acquisizione dell’immagine. Queste caratteristiche possono davvero essere determinate empiricamente solo per le esigenze di ciascun laboratorio.

Infine, questo protocollo è stato sviluppato specificamente per un microscopio confocale a scansione laser, con embrioni incorporati in una percentuale relativamente alta di agarose in una fase iniziale dello sviluppo dell’occhio. Se si esegue l’imaging in momenti diversi o in luoghi diversi durante lo sviluppo dell’occhio, questo protocollo dovrà essere adattato al processo di interesse. Attualmente sono possibili molti approcci di imaging diversi, altri sviluppati da ingegneri ottici. Ogni approccio comporta una serie di sfide, dai diversi modi di incorporare e montare embrioni per l’imaging, a file di diverse dimensioni e formati. Nel presente introduzione delineiamo le considerazioni per guidare il processo di ottimizzazione, in cui la massima risoluzione spaziale e temporale è bilanciata con fotosciviazione, fototossicità e dimensioni di file immense. Speriamo che questi principi generali, oltre alle informazioni pratiche sopra descritte, aiuteranno gli altri a stabilire approcci di imaging timelapse per studiare le molte domande aperte nello sviluppo degli occhi.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati ai membri passati e presenti del Kwan Lab per il lavoro sugli approcci timelapse e le discussioni su questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01 EY025378 e R01 EY025780 a KMK; F31 EY030758 a SL; e T32 GM007464 a MAC).

Materials

Delta TPG Dish 0.17mm clear Bioptechs 0420041500C coverglass bottom for optical compatibility
Disposable Pasteur Pipettes VWR 14672-608 overall length 14.6 cm (53/4")
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps Fine Science Tools 11254-20 For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter P-97
Immersol W Carl Zeiss Microscopy 4449690000000 immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence
Microinjection Mold Adaptive Science Tools TU-1 Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side.
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340 contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature.
Nikon SMZ645 Stereo Microscope Nikon SMZ645 used for injecting embryos (see Fig. 2B)
NotI-HF enzyme NEB R3189S comes with Gel Loading Dye, Purple (6X)
NuSieve GTG Agarose Lonza 50081 fine resolution, low melt agarose
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 Carl Zeiss Microscopy 421867-9970-000
Olympus SZX16 Stereo Microscope Olympus SZX2-ZB16 used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A)
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested
Pico-liter Microinjector Harvard Apparatus PLI-100 Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold
Pipette Pump Pipettor SP Bel-Art F37898 fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries Warner Instruments G100T-4 1.0 x 0.78 mm
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml)
RNase-free H2O Invitrogen AM9906 DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 Carl Zeiss Microscopy 432339-9000-000
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal Carl Zeiss Microscopy 432339-9030-000
Zeiss LSM 880 with Airyscan Carl Zeiss Microscopy N/A inverted Axio Observer microscope
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss Microscopy N/A Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss
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Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M. 4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis. J. Vis. Exp. (171), e62155, doi:10.3791/62155 (2021).
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