斑马鱼光学杯形态形成的四维成像

这里描述的所有使用斑马鱼的方法都包含在Kristen Kwan博士的动物协议”斑马鱼视觉系统发展的细胞和分子机制”中，并得到了犹他大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。 1. 盖住RNA合成 生成体外转录的DNA模板。 通过在反应混合物的 100 μL 体积中消化 10 微克的 DNA，将 DNA 模板线性化。典型的反应组合如下：使用 3 μL 的酶和 10 μL 的缓冲器消化 10 μg DNA，将反应体积与水一起达到 100 μL。注：一个典型的模板消化是PCS2载体，例如，PCS2-EGFP-CAAX或PCS2FA-H2A.F/Z-mcherry的膜和色度素标签在这里描述。在这种情况下，质粒DNAs是每个消化使用酶诺蒂。用户应谨慎对待明星活动：在这种情况下，建议使用高保真度酶并提供商业服务。 在 37 °C 的夜间孵育反应，以确保 DNA 被消化到完成。 按照制造商的协议使用 PCR 净化套件清理限制摘要。将DNA与30微升ddH2O.一起，将线性DNA存储在-20°C，并根据需要使用。注：消化的DNA量和脱氧核糖核酸量产生约0.3微克/μL;这足以满足 +5 轮体外转录， 每轮使用 +2 μg 的 Dna 作为模板。 使用体外转录套件进行体外转录封顶 RNA。对于 PC2 模板（如此处所述），请使用 SP6 套件。 组装体外转录反应，如下： 文摘 2 μg DNA 模板或高达 6 μL 与 2 μL 的 10 倍反应缓冲器， 10 μL 的 2x 核糖核苷酸混合， 和 2 μL 的 10 倍酶混合. 在 37 °C 下孵育 2-4 小时或更长时间（更长的时间将导致更高的产量）。如果需要，1微升的酶混合可以在潜伏期的中途补充。 通过添加 1 μL 的无 Rnase DNase 并在 37 °C 下孵育 15 分钟来消化 DNA 模板。 按照制造商的协议（参见 材料表），使用 RNA 净化套件净化封顶 RNA。Elute 与 100 微升的无 Rnase H2O 。注：本应用不需要添加β-甲醇。虽然此协议中描述的方法很简单，但替代试剂也可用于净化 RNA。 沉淀RNA。 将 10 μL 的 3 M 无 RNase NaOAc 和 2.5 卷 （+275 μL） 的无冰冷无 Rnase 100% EtOH 添加到无冰冷 RNA 中。 将反应在 -20 °C 下孵化 15-30 分钟。在 4 °C 高速旋转 15 分钟，以颗粒 RNA。注：颗粒应在管壁上可见。在此步骤中，请注意离心机中的管子是如何对齐的，以便预测颗粒在旋转结束时的位置。 用注射器小心地取出 EtOH，小心避免加热、过度干燥或脱落颗粒。在 20 微升的无 Rnase H2O 中重新使用颗粒。 检查RNA以确保合成成功。使用 1 μL 检测光谱仪上的浓度，在 1% 的玫瑰凝胶上运行 0.5 μL，以检查一个或两个离散频段，而不是低分子量涂片。体外转录反应的产量应为 ±1 μg/μL。 阿里库特和存储RNA在-20°C或-80°C。 直到注射前，RNA 才稀释。 2. 1细胞斑马鱼胚胎的微注射 注：每RNA注射200-300 pg，在整个光学杯形态形成过程中获得色素和细胞膜的无所不在的表达。准备 5-10 μL 的 RNA 稀释，并加载 2.5-5 μL/needle;计划额外的，如果针头断裂。 提前准备注射。 准备注射模具盘，以促进1细胞胚胎的对齐和定向进行微注射。在E3（标准胚胎介质）中融化2%的玫瑰，倒入培养皿中。小心地将注塑模具（参见 材料表）漂浮在热气糖的顶部，以在气精凝固时产生气垫槽的印记。一旦阿加罗斯凝固，取出注塑模具。注：注：注塑盘可使用数月：覆盖在 E3 中，在不使用时存储在 4 °C。 拉微注射针。将玻璃毛细血管拉到长锥形器上，使用拔针机制作微注射针。对机器进行特定于所用毛细血管类型的编程。对于 1.0 x 0.78 mm 玻色硅酸盐毛细血管使用以下程序： 热 = 546 °C， 拉 + 130， 速度 = 70， 时间 = 90 （图 2F）.将针头存放在培养皿中，并用建模粘土固定。注意：拉力配方会有所不同，具体取决于机器和灯丝，并且应始终校准新细丝。每轮拉力产生两针（图2G）：这样做几次，以产生足够的针头，以防意外中断和未来的实验。 稀释封顶RNA进行注射。使用无 RNase H 2 O 和 1 μL 的苯酚红色，将 EGFP-CAAX 和 H2A-mCherry RNA 的浓度稀释至 200-300 ng/μL 浓度，总体积为 5 μL（苯酚红色最终浓度为 0.1%）。轻拂混合物并短暂旋转以收集总体积。注射前将稀释的RNA留在冰上。 注射1细胞胚胎 一旦鱼开始繁殖，允许15-20分钟，以确保鸡蛋受精。在此期间，使用 P10 和 P10 微型装载机尖端，用 2.5-5 μL 的 RNA 稀释回针头。 使用笔切射射体，使用目镜灯片校准针头（微米校准滑梯也足够），以测量液滴的体积（球体体积 = （4/3） * pi * 半径+3）。调整注射时间和压力，使注射体积为1nL（图2I）。 用滚筒/转移移液器，小心地将鸡蛋装入注塑模具（图2J）。如果有帮助，使用钳子滚动胚胎，使单个细胞可见，无论是在注射之前还是在注射期间。用户倾向于使用微操纵器。 在1细胞阶段注射胚胎，瞄准细胞而不是蛋黄（图2M）。这将确保发育中的胚胎的统一标记。 将胚胎提升到所需的阶段（在12马力之前，根据标准分期34）。注射的胚胎将有一个延迟的发展，所以提高他们在一个稍微高一点的温度（29.0-29.5°C），以弥补时间。下午，检查胚胎并取出那些已经死亡，以保持离合器的健康。 3. 安装光学囊泡阶段斑马鱼胚胎进行时垂成像 安装前，在E3中准备1.6%的低熔化气。如果计划进行多个成像实验，准备 ±20 mL 的低熔融玫瑰，并在室温下储存。在胚胎安装当天，熔化在安装前的管子中产生新鲜的阿利库特（1-5 mL），该管子可以放置在 42 °C 的热块中。 安装前使用荧光显微镜成功注射和荧光整体亮度的屏幕胚胎。理想的样品将具有很强的EGFP和麦片荧光，并处于正确的发育阶段（图3B-B’）。 使用荧光显微镜筛选胚胎。选择能强烈表达EGFP和麦切里荧光的胚胎进行安装。 选择11马力的胚胎。数一数，以适当分阶段胚胎34：在 11 hpf 应该有 3 个烟草， 到 12 hpf 有 6 个闷闷不乐。注：通过在 12 hpf（11 hpf）之前安装胚胎，当时间延误开始时，样本将以 12 hpf 的适中分级。 安装前将胚胎脱钩。手动使用细钳或化学使用假肢（2毫克/毫升）。对于如此年轻的胚胎，在涂有阿加涂层的盘中进行脱毛和胚胎不能接触空气-水接口是至关重要的。 使用玻璃滚筒移液器，吸出胚胎并弹出尽可能多的E3，使胚胎位于玻璃巴斯德移液器的尖端。 将胚胎从热块中滴入藻子管中。让它沉入阿加罗斯几秒钟，然后先吸一些阿加罗斯，然后吸出胚胎，确保胚胎保持在移液器的尖端（图3C -C’）。 将玻璃底盘置于解剖范围下进行成像。将胚胎弹出，并放入玻璃底盘中的玫瑰水滴中。使用钳子快速定向，使胚胎向下（玻璃底部的头顶）。让玫瑰水滴硬化（图3D – D’）。这一步骤必须迅速而谨慎地完成，因为现阶段的胚胎是脆弱的。受损的胚胎无法在时间拉伤成像过程中存活下来。注：重要的是要为这个实验始终定向所有胚胎。执行时间拉时时时，胚胎必须适合指定的视野，同时保持额外的空间，使光学囊泡成长。最佳定位是将所有胚胎的前后轴”垂直”对齐，或沿12点和6点钟在钟面上对齐（图3G）。 安装在10-12个胚胎之间，这是图像的两倍多，因此，一旦对共聚焦进行评估，就可以选择最好的样本（图3E-E’）。 样品将根据年龄、荧光标签的均匀性和安装方向的精度进行评估。 安装胚胎后，移液器更阿加罗斯完全覆盖盘底，从而将所有单独的玫瑰液滴包裹在一个大的玫瑰盘中（图3F-F’）。 足够的玫瑰将确保单个胚胎液滴或整个盘不会从盘底抬起并浮出视线。 一旦硬化，将 agarose 与 E3 覆盖，以便在延时成像实验期间保持样品水分（这取决于建筑物的湿度和环境中的安全问题）。注：对于这些特定的定时时成像实验来说，三卡因是没有必要的，因为这些胚胎足够年轻：然而，如果需要的话，如果与胚胎的较旧阶段配合，三卡因可以添加到玫瑰本身，并覆盖在媒体上。 在纸上，绘制胚胎地图，以便在时间延误期间提供方便参考。这对于以后将该位置与每个样本的基因型关联至关重要。 4. 使用激光扫描共聚焦显微镜进行多个位置共聚焦时间拉伸 注：此超时成像协议设计用于配备制造商软件的激光扫描共聚焦显微镜（参见 材料表）。该系统配备了一个Piezo Z级设备，允许快速获取Z堆栈。本协议中使用的激光线为 488 nm Argon 离子激光器和 DPSS 561 nm 激光。561 nm 激光非常适合成像 mCherry 荧光：它离 mCherry 激发 （587 nm） 的峰值足够近，而且动力充足。 设置焦。 在主机上供电并登录台式计算机。 安装 Piezo Z 级插入件（图 4B），然后启动采集软件。 在 “获取 “模式下的软件中，使用下拉菜单（图 4F）打开488和 561 激光。激光需要几分钟来预热，因此此步骤提前执行以节省时间。注：获取参数如下：检查Z 堆栈、时间系列和位置框。将帧大小设置为 512 （X） x 384 （Y），扫描速度至 9，扫描模式设置为双向，缩放到 0.7，平孔设置为 60.2（1.63 Airy 单元 == 1.6 μm 部分），Z 间隔设置为 2.1 μm。这将产生 303.6 μm x 227.7 μm 的图像大小，像素大小为 0.59 μm。应检查488和561激光器并分配到同一轨道：EGFP 检测范围为 494-545 nm，mCherry 检测范围为 598-679（图 4F）。 随意涂上玻璃盘底部的浸入介质，与水的折射指数相匹配，小心避免气泡（图4C）。选择40倍水的目标，并应用一小滴浸入介质到目标（图4D）。固定在舞台插入的玻璃底盘，应用E3保持胚胎湿润过夜，然后使用建模粘土密封在盘子上的塑料盖（图4E）。提高与菜接触的目的。 筛选样品并准备时间拉时。 从 “获取 “选项卡切换到 “定位 “选项卡，然后单击灯泡符号以打开传输的光。使用传输的光，用操纵杆定位第一个样品：通过眼睛，首先将样品移入光束中，然后使用目镜到中心，并聚焦在光学囊泡上。 返回到 收购 选项卡。确保检查 Z 堆栈、 时间系列和 位置 框，并预热激光以供使用。 将 帧大小 设置为 512 （X） x 384 （Y）， 将扫描速度 设置为 9，将 扫描模式 设置为双向，并将 缩放 设置为 0.7。 在 通道 标题下，首先将 488 和 561 激光分配到 Power 2.0 和 Gain 550（稍后可以调整）。将 针孔 设置为 60.2（1.63 通风单元 +1.6 μm 部分）。 开始使用 连续 按钮进行扫描。通过精细的对焦旋钮，将样品定位在 Z 轴中，并将 X-Y 轴放置在框架中。停止扫描。 在 “位置 “标题下，单击 “添加” 以保存第一个示例上的 XYZ 信息（图 4F）。这样做只是为了使样品被定时。选择样品，以获得强荧光和最佳安装。 切换到 Locate 选项卡，移动到下一个示例，并重复步骤 4.2.5-4.2.6，选择选择示例。 完成示例位置，分配 z 范围，然后开始时间拉时。一旦选择所有样本（可在 2.5 分钟的总时间间隔内对 4-5 个样本进行成像），并保存位置，请浏览每个样本并在查看帧内调整 XYZ 位置。 突出显示第一个位置，然后单击 “移动到”。在持续扫描时，将光学囊泡排列在帧内。相对于光学囊泡和大脑，在前部和相向区域留出充足的空间。 接下来，通过选择 “设置第一 “和” 设置最后 “来分配第一个和最后一个 Z 切片，同时通过具有精细对焦旋钮的 Z 方向。保持 63 的切片总数，因为这将适应光学杯的生长。在光学囊泡的腹腔侧提供额外的空间，以留出生长空间。 设置第一个和最后一个 Z 切片后，单击 C 按钮以移动到 Z 堆栈的中心。调整激光功率和两种激光的增益：如果可能，将激光功率保持在 5 以下，并在必要时使用更高的增益。停止扫描。点击” 更新”更新位置信息。 单击位置 2 移动到下 一个位置。每个分配的职位重复步骤 4.3.1-4.3.3。激光功率和增益应设置为所有样品都有足够的照明。 位置信息和激光设置完成后，分配时间系列设置。在 时间系列 标题下，将 时间间隔 分配为 2.5 分钟， 将周期 分配为 300（图 4F）。计算周期数，当光学杯开发完成时，时间段会超过 24 hpf 阶段。 要开始时间拉时，请单击 “开始”。监控第一个完整周期：使用定时器确保一个完整周期（成像所有位置）小于 2.5 分钟，并验证每个位置看起来正确。显微镜独立运行一夜，无需监控。注：虽然主室温度得到控制，但室温为 20-25 °C。 随着设备的运行和激光扫描，舞台上的温度似乎接近28.5°C，因为胚胎发育以这个预期的速度进行，如视觉上与形态地标的测定。 有了这些设置，时间会持续 12.5 小时。一旦时间拉时完成，请保存文件。它将是大（+40 GB），并可以分为个别位置后，它保存使用收购软件。