Murine Yaralarında Biyofilm Dağılımının Değerlendirilmesi
Summary
Burada, farelerdeki bir yara enfeksiyonundan bakteriyel dağılımı değerlendirmek için ex vivo ve in vivo yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, topikal antimikrobiyal ve anti-biyofilm tedavilerinin etkinliğini test etmek veya farklı bakteri suşlarının veya türlerinin dağılım kapasitesini değerlendirmek için kullanılabilir.
Abstract
Biyofilme bağlı enfeksiyonlar, iyileşmeyen diyabetik ayak ülserleri, kronik sinüzit, tekrarlayan otitis media ve daha fazlası gibi çok çeşitli kronik durumlara bulaşmıştır. Bu enfeksiyonların içindeki mikrobiyal hücreler, antibiyotiklerin ve konak bağışıklık hücrelerinin enfeksiyonu temizlemesini önleyebilen hücre dışı polimerik bir madde (EPS) ile korunmaktadır. Bu engeli aşmak için, araştırmacılar potansiyel terapötikler olarak dispersiyon ajanları geliştirmeye başladılar. Bu ajanlar biyofilm EPS içindeki çeşitli bileşenleri hedef alarak yapıyı zayıflatır ve teorik olarak antibiyotik gücünü ve bağışıklık açıklığını artırabilen bakterilerin dağılmasını başlatır. Dispersiyon ajanlarının yara enfeksiyonları için etkinliğini belirlemek için, biyofilm dispersiyonunu ölçen protokoller geliştirdik hem ex vivo hem de in vivo . Biyofilm ile ilişkili kronik yara enfeksiyonları oluşturmak için iyi tanımlanmış bir fare cerrahi eksizyon modeli kullanıyoruz. Dispersiyon in vivoizlemek için, yaralara luciferaz eksprese bakteriyel suşları bulaştırırız. Olgun enfeksiyonlar ortaya çıktıktan sonra, yaraları biyofilm EPS bileşenlerini bozan enzimler içeren bir çözelti ile sularız. Daha sonra elde edilen dağılım seviyesi hakkında bilgi sağlamak için yara ve filtreleme organlarındaki parlaklık sinyalinin yerini ve yoğunluğunu izliyoruz. Biyofilm dispersiyonunun ex vivo analizi için, enfekte yara dokusu biyofilm bozan enzim çözeltisi içine batırılır, daha sonra dokuda kalan bakteri yükü ile çözeltideki bakteri yükü değerlendirilir. Her iki protokol de güçlü ve zayıf yönleri vardır ve dağılım tedavilerinin etkinliğini doğru bir şekilde belirlemeye yardımcı olmak için optimize edilebilir.
Introduction
Dünya çapında antibiyotik direncinin artması, çeşitli bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek için antibiyotik seçeneklerinin eksikliğine yol açar1. Antibiyotik direncine ek olarak, bakteriler biyofilm ile ilişkili bir yaşam tarzı benimseyerek antibiyotik toleransı kazanabilir2. Biyofilm, toplu olarak hücre dışı polimerik madde (EPS) olarak adlandırılan polisakkaritler, hücre dışı DNA, lipitler veproteinler 3matrisi ile korunan bir mikroorganizma topluluğudur. Antibiyotik direnci krizi devam ettikçe, antibiyotiklerin kullanımını uzatan veya etkinliğini etkileyen yeni stratejilere şiddetle ihtiyaç vardır. Anti-biyofilm ajanları umut verici bir çözümdür4.
Önerilen farklı anti-biyofilm stratejileri arasında, biyofilm EPS’nin farklı bileşenlerini hedefleyen dispersal ajanların kullanımı terapötik gelişimin ön saflarında yer almaktadır5. Glikozit hidrolazları (GH) bu tür bir dispersiyon maddesi sınıfıdır. GH, EPS’ye yapısal bütünlük sağlayan polisakkaritler içindeki farklı bağların bölünmesini katalİze eden büyük bir enzim sınıfıdır. Grubumuz ve diğerleri, GH’nin biyofilmleri etkili bir şekilde bozabileceğini, dağılmayı teşvik edebildiği ve hem in vitro hem de in vivo6 , 7 ,8,9,10,11gibi bir dizi farklı bakteri türü için antibiyotik etkinliğini artırabileceğini göstermiştir.
Biyofilm dispersiyona artan bir ilgi ile, dispersiyon etkinliğini değerlendiren etkili yöntemler geliştirmek önemlidir. Burada, farelerde bir dispersiyon ajanı ile biyofilm ilişkili yara enfeksiyonlarının tedavisi ve dağılım etkinliğinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, in vivo ve ex vivo. Genel amaç, biyofilm dağılımını etkili ve verimli bir şekilde ölçmek için preklinik modellerle kullanılabilecek etkili yöntemler sağlamaktır.
Bu çalışmalarda biyofilm ilişkili bir enfeksiyon oluşturmak için bir murine cerrahi eksizyon enfeksiyon modeli kullanılmıştır. Biz 15 yılı aşkın bir süredir bu modeli kullandık ve gözlemlerimizi kapsamlı bir şekilde yayınladık7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Genel olarak, bu, bakterilerin yara yatağına lokalize kaldığı ve biyofilm ile ilişkili olduğu (EPS ile çevrili agregalarda görülen bakteriler), 3 haftaya kadar süren kronik bir enfeksiyon oluşturan ölümcül olmayan bir enfeksiyon modelidir. Bununla birlikte, fareler bağışıklık sistemik olarak (örneğin Tip 1 diyabet ile) bağışıklık kazanırsa, bu modelde ölümcül bir sistemik enfeksiyon geliştirmeye daha duyarlı hale gelebilirler.
Bu raporda, hem in vivo hem de ex vivo bir yaradan bakterilerin dağılımını değerlendirmek için protokoller sunuyoruz. Her iki protokol de bir dağılım ajanının etkinliğini incelemek ve kendi güçlü ve zayıf yönlerine sahip olmak için kullanılabilir. Örneğin, dağılım in vivo’nun değerlendirilmesi, bakterilerin dağıldıktan sonra vücudun diğer bölgelerine yayılması ve konağın nasıl tepki verdiği hakkında önemli, gerçek zamanlı bilgiler sağlayabilir. Öte yandan, dispersiyon ex vivo’nun değerlendirilmesi, doku ayrı ayrı test edilebilen birden fazla bölüme ayrılabileceğinden, gerekli fare sayısını azaltabileceğinden, birden fazla ajanın, dozun veya formülasyonun taranması için daha arzu edilebilir. Birden fazla ajanı değerlendirirken, genellikle daha önce açıklandığı gibi dispersiyon ilk in vitro ölçüldü 6,9,22. Daha sonra en etkili ex vivo’yu test ediyoruz ve sınırlı sayıda çok umut verici ajan için in vivo testini ayırıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada biyofilm dispersiyon ajanlarının etkinliğini incelemek için kullanılabilecek protokolleri açıklıyoruz. Bu protokoller, klinik debridman örnekleri de dahil olmak üzere farklı dispersiyon ajanları, bakteri türleri veya ex vivo örnekleri ile kullanıma kolayca uyarlanabilir. Bu protokol ayrıca dağınık bakteri hücrelerini toplamak ve incelemek için klinik olarak ilgili bir model sağlar. Dağınık bakteri hücrelerinin fenotiplerinin planktonik veya biyofilm hücrelerind…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. ve Jack Denton Wilson Vakfı ve Savunma Bakanlığı’nın (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP) hibeleriyle desteklendi.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
| 25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
| Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
| Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
| Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
| Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
| Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
| Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
| Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
| Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
| PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
| Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
| Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
| Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
| Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
| Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
| Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
| Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |
Referenzen
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
- Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
- Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
- Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
- Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
- Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. . Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
- Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
- Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
- Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
- Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
- Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
- Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).
- Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
- Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
- DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
- Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
- Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
- Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
- Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
- Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).
