הערכת פיזור ביופילם בפצעי מורין
Summary
כאן, אנו מתארים אקס ויוו ושיטות vivo להערכת פיזור חיידקים מזיהום פצע בעכברים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי לבדוק את היעילות של טיפולים אנטי מיקרוביאלית אקטואלי אנטי ביופילם, או כדי להעריך את יכולת הפיזור של זנים חיידקיים שונים או מינים שונים.
Abstract
זיהומים הקשורים Biofilm מעורבים במגוון רחב של מצבים כרוניים כגון כיבים ברגל סוכרתית שאינם ריפוי, סינוסיטיס כרונית, מדיה דלקת אוזניים חוזרת, ועוד רבים. תאים מיקרוביאליים בתוך זיהומים אלה מוגנים על ידי חומר פולימרי חוץ תאי (EPS), אשר יכול למנוע אנטיביוטיקה ולארח תאים חיסוניים מפני ניקוי הזיהום. כדי להתגבר על מכשול זה, חוקרים החלו לפתח סוכני פיזור כטיפולים פוטנציאליים. סוכנים אלה מתמקדים ברכיבים שונים בתוך ה- EPS של הביופילם, מחלישים את המבנה ויוזמים פיזור של החיידקים, אשר תיאורטית יכול לשפר את העוצמה האנטיביוטית ואת הסיווג החיסוני. כדי לקבוע את היעילות של סוכני פיזור עבור זיהומים פצע, פיתחנו פרוטוקולים המודדים פיזור biofilm הן ex vivo ו in vivo. אנו משתמשים במודל כריתה כירורגית של עכבר שתואר היטב כדי ליצור זיהומים כרוניים הקשורים לביופילם. כדי לפקח על פיזור vivo, אנו מדביקים את הפצעים עם זנים חיידקיים המבטאים לוציפראז. לאחר זיהומים בוגרים הוקמו, אנו להשקות את הפצעים עם פתרון המכיל אנזימים להשפיל רכיבים של EPS biofilm. לאחר מכן אנו עוקבים אחר המיקום והעוצמה של האות הזוהר בפצע ואיברים מסננים כדי לספק מידע על רמת הפיזור שהושגה. לניתוח ex vivo של פיזור biofilm, רקמת פצע נגוע שקוע בתמיסת אנזים משפיל biofilm, ולאחר מכן עומס חיידקי שנותר ברקמה, לעומת עומס חיידקי בתמיסה, מוערך. שני הפרוטוקולים יש חוזקות וחולשות והוא יכול להיות אופטימיזציה כדי לעזור לקבוע במדויק את היעילות של טיפולים פיזור.
Introduction
עליית עמידות לאנטיביוטיקה ברחבי העולם מובילה לחוסר אפשרויות אנטיביוטיות לטיפול במגוון זיהומים חיידקיים1. בנוסף לעמידות לאנטיביוטיקה, חיידקים יכולים להשיג סובלנות אנטיביוטית על ידי אימוץ אורח חיים הקשור לביופילם2. ביופילם היא קהילה של מיקרואורגניזמים המוגנים על ידי מטריצה של פוליסכרידים, דנ”א חוץ תאי, שומנים וחלבונים3, הנקראים באופן קולקטיבי החומר הפולימרי החוץ תאי (EPS). ככל שמשבר ההתנגדות לאנטיביוטיקה נמשך, אסטרטגיות חדשות המאריכות את השימוש, או מחזקות את היעילות של, אנטיביוטיקה נחוצות מאוד. סוכני אנטי-ביופילם הם פתרון מבטיח אחד4.
בין אסטרטגיות אנטי-ביופילם שונות שהוצעו, ניצול סוכני פיזור, אשר למקד רכיבים שונים של EPS biofilm, נמצאים בחזית הפיתוח הטיפולי5. גליקוסייד הידרולאס (GH) הם סוג אחד כזה של חומר פיזור. GH הם סוג גדול של אנזימים לזרז את המחשוף של קשרים שונים בתוך פוליסכרידים המספקים שלמות מבנית EPS. הקבוצה שלנו, כמו גם אחרים, הראו כי GH יכול ביעילות להשפיל biofilms, לגרום לפיזור ולשפר את היעילות האנטיביוטית עבור מספר מינים חיידקיים שונים, הן במבחנה והן vivo6,7,8,9,10,11.
עם עניין גובר פיזור biofilm,חשוב לפתח שיטות יעילות להעריך את יעילות הפיזור. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לטיפול בדלקות פצע הקשורות biofilm עם סוכן פיזור בעכברים, ואת ההערכה של יעילות פיזור, ב vivo ו ex vivo. המטרה הכוללת היא לספק שיטות יעילות שניתן להשתמש בהן עם מודלים פרה-קוליניים למדידת פיזור ביופילם ביעילות וביעילות.
מודל זיהום כריתה כירורגית מורין שימש במחקרים אלה כדי להקים זיהום הקשורים biofilm. השתמשנו במודל זה למעלה מ-15 שנה ופרסמנו את התצפיות שלנו בהרחבה7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. באופן כללי, זהו מודל זיהום לא קטלני שבו חיידקים נשארים מקומיים למיטת הפצע והם הקשורים לביופילם (חיידקים הנראים בצבירות המוקפות ב- EPS), ומגדירים זיהום כרוני שנמשך עד 3 שבועות. עם זאת, אם עכברים הם immunocompromised (עם סוכרת מסוג 1 למשל), הם יכולים להיות רגישים יותר לפתח זיהום מערכתי קטלני במודל זה.
בדו”ח זה, אנו מספקים פרוטוקולים להערכת פיזור של חיידקים מפצע, הן vivo ו ex vivo. שני הפרוטוקולים יכולים לשמש כדי לבחון את היעילות של סוכן פיזור ויש להם נקודות החוזק והחולשה שלהם. לדוגמה, הערכת פיזור ב vivo יכול לספק חשוב, מידע בזמן אמת על התפשטות חיידקים לחלקים אחרים של הגוף לאחר פיזור, וכיצד המארח מגיב. מצד שני, הערכת ex vivo פיזור עשוי להיות רצוי יותר עבור סינון סוכנים מרובים, מינונים, או ניסוחים, כמו הרקמה ניתן לחלק סעיפים מרובים שניתן לבדוק בנפרד, ובכך להפחית את מספר העכברים הנדרש. בעת הערכת סוכנים מרובים, אנו בדרך כלל למדוד פיזור הראשון במבחנה כפי שתואר קודם לכן 6,9,22. לאחר מכן אנו בודקים את ex vivo היעיל ביותר ומילואים בדיקות vivo עבור מספר מוגבל של סוכנים מבטיחים מאוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את היעילות של סוכני פיזור biofilm. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לשימוש עם סוגים שונים של חומרי פיזור, מינים חיידקיים או דגימות ex vivo, כולל דגימות פסולת קלינית. פרוטוקול זה מספק גם מודל רלוונטי קלינית לאיסוף וחקר תאים חיידקי…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (R21 AI137462-01A1), קרן טד נאש לונג לייף, קרן ג’ספר ל’ וג’ק דנטון וילסון ומשרד ההגנה (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
| 25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
| Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
| Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
| Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
| Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
| Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
| Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
| Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
| Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
| PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
| Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
| Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
| Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
| Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
| Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
| Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
| Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |
Referenzen
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
- Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
- Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
- Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
- Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
- Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. . Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
- Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
- Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
- Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
- Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
- Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
- Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).
- Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
- Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
- DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
- Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
- Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
- Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
- Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
- Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).
