Generation af selvsamlede vaskulære menneskelige hudækvivalenter

1. Forberedelse til 3D-kultur Forbered rotte hale kollagen lager på 8 mg / mL, ved hjælp af etablerede protokoller50,51,52. Alternativt kan rottehalekollagen købes hos leverandører (se materialelisten) i passende koncentrationer.BEMÆRK: Kollagen kan tilberedes eller købes i forskellige koncentrationer i intervallet 3-10 mg/mL eller højere50,51,52. Beregningerne i protokollen forudsætter en koncentration på 8 mg/mL, men kan justeres ud fra forskerens behov. Udvid cellelinjer: Endotel- og fibroblastceller skal være klar til såning i starten af 3D-kollagen dermal komponentgenerering (trin 2). Keratinocytter skal være klar på dag 7 af 3D-kultur. En komplet VHSE-konstruktion kræver 7,5 x10 5 endotelceller. 7,5 x 104 fibroblaster; og 1,7 x 105 keratinocytter til generation(tabel 1).BEMÆRK: Disse tætheder er passende til 12-brønds størrelse gennemtrængelige vævskulturindsatser eller tilsvarende. Celletæthed og format kan skaleres op eller ned baseret på forskerens behov. For at præcisere, denne mængde af endotel-og fibroblast celler vil frø 1-3 dermal komponenter, mens hver epidermal komponent kræver 1,7 x 105 keratinocytter. Udfør al celle centrifugering i denne protokol i 5 min ved 300 x g, men dette kan reduceres for mere skrøbelige celletyper. 2. Generering af 3D kollagen dermal komponent BEMÆRK: Trin 2 er en tidsfølsom procedure og skal udføres i én indstilling. Det tilrådes at gennemføre en kvalitetskontrol af kollagenbestanden for at sikre korrekt gelering og homogenitet, før du begynder dermal komponent såning, se fejlfinding i diskussionen. Acellulær kollagen lag forberedelse og såningForbered to 1,7 mL udjævnede mikrocentrifugerør, et til acellulær støtte og et til cellulær dermis. De mængder, der gives i dette trin, vil forberede 1 mL 3 mg/mL kollagen (målkollagenkoncentration), der er tilstrækkelig til (3) 12-brønds størrelse VHSE. Ligninger vises, hvis justering er nødvendig. Både volumen og tæthed kan skaleres på grundlag af forskerens behov (fælles referencenumre er anført i tabel 2). Til hvert rør tilsættes 100 μL dyrkningskvalitet 10x fosfatbufferet saltvand (PBS) (et rør giver 3 VHSE) og tilsættes 8,6 μL 1 N NaOH. Placer udjævnede rør på vådis for at køle i mindst 10 minutter.Cs = Koncentration af kollagenbestandVf = Sidste bind af kollagen NødvendigCt = Koncentration af målkollagenVs = Mængden af lagercollagen, der er nødvendig for den ønskede mængde (Vf)Vpbs = Volumen på 10X PBS, der er nødvendig for målkollagenkoncentrationen (Ct)VNaOH = Volumen af 1N NaOH er nødvendig for CtVmedia = Medievolumen, suspendering af opkald eller ddH2O, der kræves til Ct Der fremstilles 1000 og 250 μL positive forskydningspipetter til brug og afsæt dem. Da senere trin er tidsfølsomme, er det praktisk at indlæse pipettespidser og indstille mængder (henholdsvis 375 μL og 125 μL). Derudover skal du opsætte en normal 1000 μL pipette til 516 μL.BEMÆRK: Positive forskydningspipetter kan udskiftes med normale pipetter, hvis det er nødvendigt, men på grund af kollagenens høje viskositet og tid/temperaturfølsomhed i denne procedure anbefales positive forskydningspipetter for at hjælpe med at producere ensartede såningsresultater. Hvis du bruger normale pipetter, skal du bruge langsomme bevægelser. Forbered kulturindsatsbrøndplader: Brug sterile pincet til at placere tre 12-brønds kulturindsatser i en steril 12-brønds vævskulturplade, sted i midtersøjlerne. Angiv kolde medier, der passer til fibroblaster og endotelcelletyper. Efter afkøling af rør med loft placeres et rør (til acellulær støtte) på et stativ, hvor indholdet er synligt. Lad det andet rør (til cellulær dermis) være på is. Fjern 8 mg/mL kollagen lager fra køling og sted på vådis.BEMÆRK: Brug ikke fryseis eller -20 °C bordkølere, da dette vil fryse kollagenen. Til det kolde rør tilsættes 516 μL medier, og der tilsættes straks 375 μL kold kollagen ved hjælp af 1000 μL positiv forskydningspipette. Dispenser kollagen i opløsningen (ikke til siden af røret). Fjern straks den tomme pipettespids, og skift til den forberedte 250 μL positive forskydningspipette, der skal blandes. Bland hurtigt, men forsigtigt for at forhindre bobledannelse, fjern ikke spidsen fra opløsningen, hvis det er muligt. Bland indtil opløsningen er af homogen farve, som typisk tager omkring 5 pipettecyklusser eller 10 s (hvis du bruger medier med phenolrød, bliver farven lysere og ensartet). Når du blander, skal du sørge for at trække fra forskellige positioner af røret (bund og top) for ensartet blanding.BEMÆRK: Dette kan udføres med 516 μL vand af cellekulturkvalitet eller anden væske af cellekulturkvalitet, men phenolrød i de fleste medier er en god indikator for blandingen. Brug enten fibroblast eller endotelmedier, der blev brugt til 2D-udvidelser. 125 μL acellulær kollagen spredes straks på membranen i hver af de tre 12-brønds dyrkningsindsatser. For at sikre ensartet dækning af den acellulære kollagengel, rock skålen; Hvis det ikke skaber ensartet membrandækning, skal du bruge pipettespidsen til i det væsentlige at male membranen ved forsigtigt at sprede kollagen rundt; undgå at lægge pres på membranen. Gelation begynder næsten øjeblikkeligt; udføre dette trin hurtigt for at sikre jævn dækning.BEMÆRK: Der vil være overskydende acellulær kollagen. Volumenet kan reduceres, men at forberede mindre end 1 ml kollagenaffjedring kan resultere i vanskeligheder med at blande opløsningen og utilstrækkelig gelering. Flyt straks 12-brøndspladen til en 37 °C cellekulturinkubator for at lade den gele i mindst 20 minutter (acellulær kollagen kan gelere i længere tid, hvis det er nødvendigt; i løbet af denne geleringstid fortsæt til trin 2.2). Kollagenaffjedringen fjernes fra isen og lægges tilbage i køling (kollagenen er mest stabil ved 4 °C). Cellesuspension og såningspræparatBEMÆRK: For kultur tidslinjen for denne protokol, svarer dette til Submersion Day 1 (SD1) Under vallak af acellulære kollagen støtte, trypsinize og tælle endotel og fibroblast cellelinjer. Ophæng 7,5 x 105 endotelceller og 7,5 x 104 fibroblaster i 258 μL af deres respektive medier, og kombiner celleaffjedring for at skabe en 516 μL aliquot. Hold celleaffjedringerne på vådis, indtil de bruges. Der fremstilles 1000 og 250 μL positive forskydningspipetter til brug og afsæt dem. Da senere trin er tidsfølsomme, er det praktisk at indlæse pipettespidser og indstille mængder (henholdsvis 375 μL og 250 μL). Derudover skal du opsætte en normal 1000 μL pipette til 516 μL. Cellebelastet kollagen såning af dermal rum Efter geleringsperioden fjernes 12-brøndpladen af acellulær kollagen fra inkubatoren.BEMÆRK: Hvis denne kollagen ikke er gelé efter 30 min, skal du ikke fortsætte proceduren, da der sandsynligvis var en fejl under såning eller kollagenlageret kan have et problem (se fejlfinding i diskussionen). Fjern det 1,7 mL udjævnede rør fra vådis (indeholder 10x PBS og NaOH). Placer røret i et stativ, så indholdet er synligt. Løsn/åbn alle hætter (celleaffjedring, koldt rør med loft). Lagerkollagen (8 mg/mL) fjernes fra 4 °C-køling, og den anbringes på vådis. Lad hætten stå åben. Tilsæt 516 μL afkølet celleaffjedring til det kolde rør med loft. Brug den positive forskydningspipette på 1000 μL til straks at pipette 375 μL kold kollagenopløsning direkte ind i opløsningen af det udjævnede rør. Udvis alle kollagen fra pipette ind i røret og kassér den positive forskydning pipette spids. Skift straks til den positive forskydningspipette på 250 μL, og bland kollagenopløsningen. Bland kollagenopløsningen som afsluttet tidligere (hurtigt, men forsigtigt for at forhindre bobledannelse), fjern ikke spidsen fra gelen, hvis det er muligt. Bland indtil opløsningen er homogen (ca. 5 pipettecyklusser eller 10 s). Når du blander sørg for at trække fra forskellige positioner af røret (bund og top) for ensartet blanding. Når den er blandet, overføres straks 250 μL cellulær kollagenopløsning til de acellulære kollagenstøtter i hver af de tre 12-brønds kulturindsatser. For at sikre ensartet dækning af den acellulære kollagenstøtte skal skålen rockes og/eller bruge den positive forskydningspipette til forsigtigt at flytte den nyseedede cellulære kollagen rundt uden at forstyrre det acellulære lag. Flyt straks 12-brøndspladen til 37 °C cellekulturinkubator for at lade den gele i mindst 30 minutter. Kollagen tilbage i 4 °C-køling efter brug. Efter 30-minutters gel tid, forsigtigt vippe pladen til at vurdere gelering. Sørg for, at kollagenen er størknet. Der tilsættes henholdsvis 500 μL og 1000 μL blandingsmedier (halv endotel og halvfiblastvedligeholdelsesmedie) til det øverste kammer og underkammeret på indsatsen (først øverst og derefter nederst for at forhindre hydrostatisk tryk i at skubbe kollagen op). Tilføj medier langsomt til siden af brønden, ikke direkte på kollagen gel, for at minimere forstyrrelser af kollagen. Sørg for, at kollagengelen er nedsænket, tilsæt om nødvendigt flere medier. Placer brøndpladen i celleinkubatoren til inkubation natten over. På nuværende tidspunkt indeholder medierne 10% FBS; det normale vedligeholdelsesmedie for hver cellelinje (tidslinje og skematisk angivet i figur 1, A).BEMÆRK: Medier i hele VHSE-kulturen kan tilpasses til brugerdefinerede celletyper; nogle optimering kan være nødvendig. Ændring af medier fra 2. Skift 10% FBS medier i VHSE brønde til 5% FBS halv fibroblast, halv endotel medier suppleret med 100 μg/mL L-Ascorbinsyre. Der tilsættes 500 μL til det øverste kammer i dyrkningsindsatsen ved siden af brønden (igen tilsættes forsigtigt til sidevæggen for at minimere forstyrrelser af kollagen) og tilsæt 1000 μL til underkammeret. Forny medier hver 2. dag (SD4 og SD6) indtil indsænkningsdag 7 (SD7). Brug en manuel pipette til at fjerne medier fra brøndene. Brug af en aspirator er mulig, men kan resultere i skade eller ødelæggelse af konstruktionen.BEMÆRK: L-ascorbinsyre skal gøres frisk hver 2-3 dage (det oxiderer i opløsning for at producere brintoverilte således, fremkalde oxidativ stress og i sidste ende cellulære skader53). Således skal medierne ændres hver 2-3 dage fra SD2 til slutningen af VHSE-kulturen, da L-ascorbinsyre er til stede. Det er nemmest at lave en bestand af medier og tilføje en frisklavet mængde L-ascorbinsyre til et medie aliquot hver fodring dag. Brug vand eller medier af kulturkvalitet som opløsningsmiddel, og forbered frisk L-ascorbinsyre ved 100 mg/mL. L-ascorbinsyre stimulerer kollagensyntesen ved fibroblaster i et passende tempo og fremmer kollagenstabiliteten54,55,56; det reducerer også endotelpermeabiliteten og bevarer beholderens vægintegritet56,57 og bidrager desuden til dannelse af epidermale barrierer6,58. 3. Såning af epidermale komponenter og stratificeringsinduktion Submersion Dag 7 (SD7): frø keratinocytterBEMÆRK: Frø keratinocytter at etablere epidermis på SD7. Dette tidspunkt kan flyttes baseret på forskerens behov. Varigheden af submersionskultur uden keratinocytter bør ikke overstige 9 dage, da en længere submersion ofte fører til øget dermal sammentrækning. Hvis sammentrækning sker før SD7, anbefales det at forkorte indsænkningsperioden til 5 dage og frø epidermis på SD5. Optimer undermersionsperioden efter behov for bestemte eksperimenter (se fejlfinding i diskussionen). Kultur keratinocytter (N/TERT-120,59 eller andre egnede celler) til deres sammenløbsgrænse før trypsinisering og såning på VHSEs. For N/TERT-1-celler bør sammenløbet ikke overstige 30 % væsentligt for at forhindre uønsket differentiering af keratinocytter i 2D-kultur59. For andre relevante cellelinjer, såsom primære menneskelige epidermale keratinocytter, anvendes en sammenløbsgrænse på 75-80% generelt60. Efter trypsinisering tælles og suspenderes 510.000 celler i 600 μL human hudækvivalent (HSE) Differentieringsmedie suppleret med 5% FBS (Tabel 1).BEMÆRK: 510.000 celler i 600 μL tillader 170.000 celler/konstruktion ved såning af 200 μL pr. konstruktion (3 VHSE). Brug en manuel pipette, indsamle og kassere medier i øjeblikket i bunden og øverste kammer for hver konstruere godt. Sørg for at indsamle så mange medier som muligt. Opsamle medier, der kan sidde fast direkte under den gennemtrængelige membran ved forsigtigt at placere pipettespidsen under dyrkningsstregmembranen og midlertidigt slå indsatsen ud af sted. Medierne kan have siddet fast på grund af overfladespænding. Sørg for, at indsatserne sidder fladt i deres brønde, før du fortsætter. Brug af en aspirator er mulig, men kan resultere i skade eller ødelæggelse af konstruktionen. Tilføj 1 mL HSE medier suppleret med 5% FBS til det nederste kammer i hver brønd. Derefter tilsættes 200 μL celleaffjedring til det øverste kammer i hver brønd. Frø direkte på dermal konstruere overfladen. Lad keratinocytter nøjes med 2 timer i inkubatoren. To timer efter såning af keratinocytterne tilsættes forsigtigt 300 μL HSE-medier suppleret med 5% FBS til det øverste kammer i hver konstruktionsbrønd; langsomt pipette medier på siden af kulturen indsætte. Læg medierne meget omhyggeligt i det øverste kammer for ikke at forstyrre afsatte keratinocytter, der måske ikke har holdt sig tæt til den underliggende kollagengel endnu. Når mediet er indlæst, skal du placere konstruktionen tilbage i inkubatoren. 8/9-indsænkningsdag (SD8 eller SD9) HSE-medier suppleret med 1% FBS og 100 μg/mL L-ascorbinsyre. Fjern medier fra både den øverste og den nederste kamre med en manuel pipetor. Der tilsættes først 500 μL-medier i det øverste kammer og derefter 1 mL i det nederste kammer. (Dette trin kan udføres på SD8 eller SD9) 9/10 (SD9 eller SD10, dette skal være dagen efter trin 3.2) Der fyldes op serumfri HSE-differentieringsmedier med 100 μg/mL L-ascorbinsyre. Fjern medier fra både den øverste og den nederste kamre med en manuel pipetor. 500 μL indlæses i det øverste kammer og 1 mL i underkammeret. Luft-flydende grænseflade dag 1 (ALI1)BEMÆRK: ALI udføres dagen efter trin 3.3. Løft hver konstruktion til luft-flydende interface (ALI) ved at fjerne medieaffald fra det øverste kammer alene. Brug en manuel pipette til at komme så tæt på det epidermale lag som muligt uden at røre ved eller beskadige det. Vip pladen lidt i forskellige vinkler for at samle mediet. Fjern så mange medier som muligt i dette trin. Tilsæt ca. 2 mL sterilt vand til de omgivende brønde i pladen for at opretholde ensartet fugtighed; holde brønde fyldt med vand i hele kulturen. Kontroller pladen et par timer senere for at sikre, at keratinocytterne stadig er på den luftvæskegrænseflade. Hvis der er medier i det øverste kammer, skal du fjerne det. Hold styr på, hvor meget medier der fjernes for hver VHSE-brønd (Det oprindelige volumen af øvre og nedre kamre (1500 μL) – fjernede medier = et godt udgangspunkt for ALI-fodring).BEMÆRK: VHSE kræver ikke nødvendigvis det samme medieniveau for luftløft; normalt, hvis VHSEs er seedet sammen, så de har brug for omtrent samme niveau af medier til luftløft, men det er ikke altid tilfældet. Juster mængderne efter behov for at opretholde ALI, men sørg for, at medieniveauerne ikke er så lave, at VHSE tørrer ud. Det er sikrere at være forsigtig og fjerne små mediemængder dagligt, indtil en balance mellem luftløft og hydrering er opfyldt. ALI Dag 2 (ALI2) Brug fra dette tidspunkt kun serumfri HSE-medier suppleret med 100 μg/mL L-ascorbinsyre. Skift medie på ALI Dag 2 (ALI2). Hvis der er medier i det øverste kammer, skal du fjerne det og føje det til mængden af fjernede medier, der er optaget tidligere. Beregn den mediemængde, der skal bruges ved hjælp af ligningen i forrige trin. For eksempel: Hvis 200 μL medier blev fjernet fra det øverste kammer, tilsættes 1300 μL for at etablere ALI (som 1500 μL – 200 μL = 1300 μL) Brug det volumen, der er beregnet til at indlæse i det nederste kammer i hver brønd, og placer derefter pladen tilbage i celleinkubatoren. Hold styr på den mængde, der bruges pr. dag. Ved brug af de anbefalede kollagenmængder i 12-brønds dyrkningsindsatser falder det sædvanlige interval af ALI-værdier mellem 750 μL og 1300 μL. Typisk falder volumenet over dyrkningsmodning og bliver konsistent omkring uge 2/3 af ALI. Afhængigt af kulturspecifikke oplysninger kan dette nummer ændres og skal optimeres (som beskrevet i 3.4.2 – 4.1). 4. Rutinemæssig vedligeholdelse af vaskulære menneskelige hudækvivalenter Fra ALI Dag 3 (ALI3) til dyrkningsslutpunktet: Forny medier i underkammeret hver 2-3. dag ved hjælp af serumfri HSE-medier med 100 μg/mL L-ascorbinsyre. Fortsæt med at justere og spore det medieniveau, der er nødvendigt i det nederste kammer for ALI som beskrevet i trin 3.5.2. Da den epidermale overflade skal forblive i kontakt med luften, skal du kontrollere og justere medieniveauet dagligt, indtil der er etableret ensartede ALI-niveauer. Det epidermale lag skal se hydreret ud, ikke tørt, men der bør ikke være medier samlet oven på konstruktionen. Kulturer med 8 ugers ALI har givet den mest konsekvente morfologi og udtryk; Afhængigt af ansøgningen kan kulturer på 4 til 12 uger dog være hensigtsmæssige. Kulturvarighed for forskellige celle- og kulturforhold skal muligvis optimeres.BEMÆRK: Ændring af medier mandag, onsdag, fredag er en god praksis. VHSEs er sunde i løbet af weekenden, men medierne bør ændres tidligt mandag og sent på fredag. Efter helt at have afsluttet trin 1-4 er generering af en VHSE afsluttet. Trin 5-end af protokollen er valgfrie behandlings- og billedbehandlingsteknikker, der er optimeret til denne type 3D-konstruktion. 5. Fiksering og gennemtrængning af 3D-konstruktioner BEMÆRK: Trin 5 er optimeret til billedbehandlingsteknikker, der er specifikke for denne 3D-konstruktion, og som er skitseret i resten af protokollen. Følgende trin er ikke nødvendige for at oprette en VHSE. Fiksering/gennemtrængning Fjern forsigtigt alle medier fra øverste og nederste kamre i hver brønd i slutningen af kulturperioden.BEMÆRK: Det epidermale lag er muligvis skrøbeligt, håndteres med forsigtighed og omrøres ikke epidermis med aggressiv pipettering. Tilsæt 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (pH 6,9) til den øverste kammervæg (ikke direkte på konstruktionen) og derefter til det nederste kammer for at forfikse hver konstruktion. Tilsæt 1 mL pr. kammer og eksponer i 5 minutter ved stuetemperatur.ADVARSEL: PFA er farlig og bør håndteres med forsigtighed og passende personlige værnemidler (PPE), herunder øjenværn. Fjern 4% PFA-opløsning efter 5 min og tilsæt 0,5% Triton X 100 i 4% PFA-opløsning til de øvre og nedre kamre som beskrevet i det foregående trin. Eksponere i 1 time ved stuetemperatur; VHSE konstruktion kræver ikke et sterilt miljø fra nu af. Efter 1 time skal permeabiliserings-/fikseringsopløsningen forsigtigt fjernes fra begge kamre, og prøven vaskes 3 gange med 1x PBS. Prøver opbevares i PBS i 4 °C-køling eller straks plet. For at opbevare prøverne skal du pakke skålen ind i en plastfolie og derefter folie for at minimere fordampning og lyseksponeringBEMÆRK: Pausepunkt – Efter fiksering og gennemtrængning kan denne procedure standses midlertidigt, da prøverne er stabile i flere uger, hvis de er forberedt som beskrevet i trin 5.1.5. Alternativt kan farvning (som beskrevet i trin 6) udføres umiddelbart efter trin 5. 6. Immunfluorescerende farvning af 3D-konstruktioner Forberedelse af konstruktionBEMÆRK: VHSE pletter godt, når de er adskilt fra dyrkningsindsatsens porøse membran; adskillelse fra membranen er også nødvendig for ikke-blokeret billeddannelse og muliggør reducerede mængder til farvning. For at forberede konstruktionen til immunfluorescent farvning, drej en indsats på hovedet og læg den over sin brønd på brøndpladen (hvis VHSE falder, vil den falde i brønden med PBS) (Supplerende figur 1A). Stabilisere indsatsen med den ene hånd over brønden, mens du bruger fine spids pincet og / eller en præcision kniv til at skære omkring halvdelen af omkredsen af skærmembranen. Skær så tæt på plasthuset som muligt med en blid hånd for at forhindre skader på VHSE-konstruktionen. Brug de fine spidsplys, tag fat i kanten af den afskårne membranklap og skræl forsigtigt den porøse membran af indsatsen samt VHSE-konstruktionen. Gør dette meget omhyggeligt og langsomt for at forhindre skader på VHSE konstruere struktur. Hvis VHSE konstruere adskiller let så det skal falde i brønden nedenfor, hvis det sidder fast på siden af kammeret derefter bruge fine spids pincet eller en lille scoopula at flytte den til brønden. Vær meget opmærksom på det epidermale lag, da det normalt er skrøbeligt (Supplerende figur 1A).BEMÆRK: Nogle gange kommer membranen ikke let af eller kommer af i stykker, hvis dette sker, skal du bruge værktøjerne til forsigtigt at trække membranen og VHSE-konstruktionen fra hinanden. Sørg for, at VHSE’erne ikke tørrer ud under denne proces ved om nødvendigt at dyppe i PBS. Når VHSE er i brønden, kassér eventuelle resterende stykker af skærmembranen, og hold dyrkningsindsatshuset i hver brønd for at holde VHSE’erne i en nedsænket position under farvning. FarvningBEMÆRK: Farvning og tilhørende håndtering/manipulation og vask skal udføres så forsigtigt som muligt, da VHSE’er kan være skrøbelige. Hvis dele af epidermis løftes af, kan stykkerne farves separat; øverste lag af epidermis er skrøbelige og går gennem naturlig desquamation4, men til analyse er det vigtigt at opretholde integritet så meget som muligt. De valgte primære antistofpletter fremstilles i 700 μL blokeringsbuffer pr. konstruktionsbrønd (typisk kan alle primære antistoffer være i samme farvningsopløsning, men dette skal bekræftes for nye antistoffer). 700 μL arbejder for 12-brønds størrelse, men kan justeres for andre kulturformater. Anbefalede koncentrationer af primære og sekundære antistoffer med blokerende bufferopskrift er anført i tabel 3 (optimering kan være påkrævet). Fjern enhver PBS fra brønden ved hjælp af en manuel pipette, vær omhyggelig med at pipette væk fra VHSEs (da VHSEs flyder, anbefales vakuum aspiration ikke). Tilsæt den primære pletopløsning til hver brønd, og placer dyrkningsindsatshuset i brønden for at holde VHSE nedsænket i væske (Supplerende figur 1B). Pak brøndpladen ind med plastfolie. Folie og plet i 48 timer i 4 °C køling uden omrøring eller rokkende (rokkende kan beskadige VHSE-konstruktionen). Efter 48 timer fremstilles sekundære antistoffer og kemiske pletter i 700 μL blokerende buffer (pr. brønd). Fjern dyrkningsindsatshuset og den primære pletopløsning og vask med 1x PBS, 3x i 5 minutter, før du tilføjer den sekundære pletopløsning. Placer kulturindsatshuset tilbage i brønden for at holde VHSE-konstruktionen nedsænket (Supplerende figur 1B). Udsættes for 48 timer i 4 °C køling uden omrøring eller rokkende. Efter 48 timers eksponering fjernes pletopløsningen med en manuel pipetor og vaskes forsigtigt 3x med PBS; Rør ikke væske direkte på VHSEs, da de kan være skrøbelige. Rehydrere med overskydende PBS og placere kulturindsatsen huset tilbage i brønden for at holde VHSE nedsænket og hydreret under opbevaring (opbevares ved indpakning i plastfolie og folie for at minimere fordampning og lyseksponering) Rydning (valgfrit og terminal)BEMÆRK: Rydning er valgfri til billedbehandling. Hvis det er afsluttet, skal det ske efter farvning/billeddannelse af prøven helt, da rydning forhindrer yderligere farvning, kan ændre fluorophore ydeevne og kan beskadige VHSE-strukturen. Flere vævsrydningsmetoder findes49,61,62 og kan optimeres til specifikke projekter. Methylsalikalat clearing, beskrevet nedenfor, er både enkel og effektiv for VHSE. Følgende rydningsteknik skal være afsluttet i glasbeholdere, og pipettespidserne skal være glas eller polypropylen (polystyren opløses i kontakt med methylsasylat). Fuldfør alle rydningsproceduren i et godt ventileret område eller røghætte. Tilsæt 100% methanol til en lille lavvandet glasbeholder (glas Petri retter fungerer godt). Brug den mindst mulige beholder, der passer til konstruktionen (for at minimere reagensaffald). Fjern konstruktionen fra brøndpladen ved hjælp af pincet/scoopula (Supplerende figur 1C) og læg den i den methanolfyldte beholder. Tilsæt mere methanol, hvis konstruktionen ikke er nedsænket. VHSE-konstruktionen dehse i methanol i 3 x 10 min. methanol udskiftes fuldt ud efter hver nedsænkning, og methanol fjernes straks efter det sidste bad. I løbet af denne procedure kan konstruktionen blive mere uigennemsigtig og krympe lidt.BEMÆRK: Disse varigheder og gentagelser er blevet optimeret, men methanol og følgende methylsalikalatprocedurer skal muligvis tilpasses afhængigt af det specifikke kulturformat og pletter. Umiddelbart efter fjernelse af methanol tilsættes methylsalikalat og nedsænkes VHSE i 5 x 5 min. nedsænkninger. Reagenset udskiftes helt efter hver nedsænkning, og VHSE efterlades i den 5. nedsænkningsopløsning til opbevaring. I løbet af denne procedure bliver konstruktionen gennemsigtig. Billedet konstrueres eller opbevares ved 4 °C. Efter rydning skal al billedbehandling fuldføres så hurtigt som muligt, da fluorophorerne kan nedbrydes i methylsalikalat inden for få dage. Rydning får konstruktionerne til at blive sprøde, og den udvidede opbevaring, selvom det ikke anbefales, har brug for en regelmæssig kontrol for at sikre, at der er en tilstrækkelig mængde methylsalikalat. 7. Confocal Imaging af 3D-konstruktioner BEMÆRK: Billeddannelse gennem vævskultur plast vil ikke give den samme kvalitet af billedet som billeddannelse gennem coverlip glas, denne metode beskriver fremstilling af en brugerdefineret glas-bund godt for at forhindre tørring under konfokale billeddannelse. Dette er typisk tilstrækkeligt til mindst 3 timers billeddannelse. To dage før billeddannelse: forbered polydimethylsiloxan (PDMS) Forbered PDMS48,63,64 ved en foreslået koncentration på [9:1], base: crosslinker. Forbered 30 g PDMS i alt: 27 g basiskomponent og 3 g crosslinker. Placer enhver ren blandingsbeholder på en vejebalance, og tjære vægten. Tilsæt basen (27 g), og tilsæt derefter crosslinkeren (3 g) for at opnå i alt 30 g. Tilføj altid base før crosslinker. Opløsningen omrøres kraftigt i mindst 4 min. dette vil skabe små bobler. Efter tilstrækkelig blanding hældes PDMS i en 100 mm petriskål eller lignende flad bundvarmebestandig beholder. Afgas PDMS i et vakuumkammer, indtil alle bobler fra blanding forsvinder, og PDMS er klart. Vakuumet slippes langsomt, og PDMS’et fjernes (langsomt). Skålen anbringes i en ovn for at hærde natten over (50-60 °C). sørg for, at skålen sidder fladt, så PDMS kan hærde jævnt.BEMÆRK: Efter hærdning skal PDMS være klar, og overfladen skal være glat og ikke klæbrig (klæbrighed kan indikere utilstrækkelig blanding). En dag før billedbehandling: PDMS brøndforberedelse Ved hjælp af en stålpunch eller håndholdt præcisionskniv skal du slå eller skære en cirkulær brønd ud af PDMS-arket, der er forberedt i 7.1. Brønden skal være omkring samme størrelse som VHSE-konstruktionen. Skær en firkantet patch rundt om den cirkulære brønd for at skabe en enkelt PDMS-brønd. Den forberedte PDMS-mængde på 30 g skal give mindst fire brugerdefinerede brønde.BEMÆRK: PDMS-brønden skal være tæt på størrelsen på VHSE-konstruktionen. Det skal snøre prøve bevægelse under billeddannelse. Flere brønde kan fremstilles på én gang og opbevares på ubestemt tid i en ren beholder. Brug en glasovertræksplade af samme størrelse som PDMS-brønden, tilsæt cyanoacrylatlim (f.eks. superlim) til bunden af PDMS (den glatte overflade, der var i kontakt med Petri-skålen) og smør jævnt med en engangs pipettespids. Centrer, og tryk PDMS godt på glasset, mens du efterlader et klart glasvindue i den stansede cirkel (sørg for, at limen ikke er smurt over visningsvinduet).BEMÆRK: Hvis det er muligt, plasmabinding af PDMS til coverlip er et alternativ65,66,67. Lad limen tørre i flere timer eller natten over, før du bruger. Disse kan genbruges, indtil de bryder fra normal slitage.BEMÆRK: Det anbefales ikke at plette prøverne i den limede PDMS, der bruges til billedbehandling. Disse brønde holde væske i flere timer, men kan lække under længere farvning. VHSE-billedbehandlingBEMÆRK: Hvis billeddiagnostiske, uklare prøver, skal du bruge PBS som billedopløsning. Hvis der er billeddannelse med klare prøver, skal du bruge methylsallat (eller den valgte rydningsopløsning) som billedopløsning. Tilføj et par dråber billedopløsning i PDMS-brønden og kontroller for lækager (hvis der er en lækage, skal du reparere den med en prik / smør af cyanoacrylat superlim eller bruge en anden brønd). Hold billedløsningen i PDMS godt, når du tilføjer VHSE. Brug scoopula eller fine spids tang (Supplerende Figur 1C), fjerne konstruere fra 12-brønd plade og sted i PDMS godt på glasset coverlip. Placer konstruere med orientering af interesse vender mod målet. For eksempel, at billedet epidermis ved hjælp af en omvendt mikroskop, skal du sørge for epidermis vender nedad, mod glasset. Alternativt, for en opretstående mikroskop, står over for epidermis op. Nedenstående billeddannelsesprocedurer er beskrevet for et omvendt mikroskop, men kan let tilpasses til en opretstående.BEMÆRK: Vær forsigtig, når du manipulerer VHSE for at undgå skader. Overfør over brøndpladen, hvis VHSE falder. En bøjet, flad spids scoopula er den nemmeste måde at overføre konstruktionen (Supplerende Figur 1C). Sørg for, at prøven sidder fladt i brønden, og at ingen dele af epidermis eller dermis foldes under prøven. Hvis der sker foldning, skal prøven forsigtigt manipuleres med pincet eller en scoopula. hvis du tilføjer ekstra billedopløsning midlertidigt for at flyde VHSE, kan det hjælpe med at rette ud. Foldning eller rynker af prøven kan ses med øjet eller ved hjælp af mikroskopet. Fyld brønden med billedopløsning, ved hjælp af lige nok væske til at holde prøven hydreret; for meget væske vil flyde prøven, hvilket resulterer i bevægelse under billeddannelse. Konstruktionen skal sidde på glasvisningsvinduet; bevægelsesprøve ved at vippe PDMS-brønden. Hvis der er bevægelse, skal du fjerne noget væske; tilsæt og fjern væskedråbe klogt, indtil bevægelsen stopper. Placer et glas dias over brønden for at minimere fordampning under billeddannelse(Supplerende Figur 1D). Ved længere billedbehandlingssessioner skal du kontrollere prøven ofte for at sikre korrekt væskeniveau. Hvis det er tilgængeligt, kan et befugtet kammer under billeddannelse bruges (selvom det typisk ikke er nødvendigt). Prøven anbringes på mikroskopstadiet, og billedet gennem vinduet med glassdæksler(supplerende figur 1D). Denne teknik giver mulighed for mindst 3 timers kontinuerlig konfokal billeddannelse, men hydrering af prøven skal kontrolleres regelmæssigt, og billedopløsning tilsættes, når det er nødvendigt.BEMÆRK: Hvis prøven ryddes, vil methylsalkolat nedbryde limen over tid. Limen, der binder PDMS’et, kan anvendes på en måde mellem billedkørsler. eller prøven kan overføres til nye brønde med jævne mellemrum. I brønde med plasmabinding vil dette ikke være et problem. Efter billeddannelse, flyde prøven med billedvæske så meget som muligt i brønden. Brug en scoopula eller fine spids tang til at overføre prøven til opbevaringsbrønden. Udfør overførslen over en brøndplade, hvis prøven falder. Hver PDMS godt og top glas coverlip kan genbruges, indtil de går i stykker. Rengør bundglas før billeddannelse, både i og uden for brønden. Før genbrug skal du altid kontrollere for lækager og reparere med lim efter behov. Gem prøver som beskrevet i trin 6.3.6, og tilsæt PBS med få måneders mellemrum for at vedligeholde dem. hvis prøverne er ryddet, opbevares i glas ved hjælp af methylsalkolat, og niveauerne kontrolleres regelmæssigt. Ryddede prøver kan nedbrydes hurtigt (inden for få dage) og skal afbildes så hurtigt som muligt.