自组装血管化人体皮肤等价物的生成

1. 3D 文化的准备 准备老鼠尾胶原蛋白库存在8毫克/mL，使用既定的协议50，51，52。或者，大鼠尾胶原蛋白可以以适当的浓度从供应商处购买（参见材料列表）。注：胶原蛋白可在3-10毫克/mL或高于50、51、52的不同浓度下制备或购买。协议中的计算假设浓度为 8 毫克/mL，但可以根据研究人员的需要进行调整。 扩大细胞系：内皮细胞和成纤维细胞需要准备好在3D胶原蛋白皮肤成分生成（第2步）开始播种。角蛋白细胞需要在3D文化的第7天准备好。一个完整的VHSE构造需要7.5 x 105 内皮细胞：7.5 x 104 成纤维细胞;和 1.7 x 105 角蛋白细胞为一代 （表 1） 。注意：这些密度适用于 12 井大小的透渗透组织培养插入或等效。细胞密度和格式可以根据研究人员的需求向上或向下放大或缩小。为了澄清这一量的内皮和成纤维细胞将播种1-3皮肤成分，而每个表皮成分需要1.7 x 105 角蛋白细胞。 在此协议中执行所有细胞离心，在 300 x g下执行 5 分钟，但对于更脆弱的细胞类型，这可能会减少。 2. 3D胶原蛋白皮肤成分的生成 注意：第 2 步是一个时间敏感程序，必须在一个设置中完成。建议在开始皮肤成分播种之前完成胶原蛋白库存的质量检查，以确保适当的凝胶和均质性，请参阅讨论中的故障排除。 细胞胶原蛋白层制备和播种准备两个1.7 mL封顶的微中性管，一个用于细胞支撑，一个用于细胞真皮。此步骤中给出的量将准备 1 mL 的 3 毫克/mL 胶原蛋白（目标胶原蛋白浓度），足以满足 （3） 12 井大小的 VHSEs。如果需要调整，则列出方程。体积和密度都可以根据研究人员的需求进行缩放（表 2中给出了常见的参考编号）。 在每个管中，添加 100 μL 的文化等级 10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （一管将产生 3 VHSE）， 并添加 8.6 μL 的 1 N NaOH。将盖管放在湿冰上冷却至少10分钟。Cs = 胶原蛋白库存浓度Vf= 需要胶原蛋白的最终卷Ct= 目标胶原蛋白浓度Vs = 所需的库存胶原蛋白量 （Vf）Vpbs = 目标胶原蛋白浓度所需的 10 倍 PBS 体积 （Ct）V纳赫=Ct所需的1N纳赫体积V媒体=Ct所需的媒体量、呼叫暂停或ddH2O 准备 1000 和 250 μL 正位移移液器，供使用并预留。由于后一步对时间敏感，因此加载移液器提示和设置体积（分别为 375 μL 和 125 μL）非常方便。此外，为 516 μL 设置一个正常的 1000 μL 移液器。注意：如有必要，正位移移器可与普通移液器替代，但由于胶原蛋白的高粘度和此过程的时间/温度敏感性，建议使用正位移移如果使用正常的移液器，请使用慢动作。 准备培养插入井板：使用无菌钳将三个12井大小的培养物插入无菌的12井组织培养板中，放入中心柱中。 设置适合成纤维细胞和内皮细胞类型的冷介质。 封顶管冷却后，将一根管子（用于细胞支撑）放在机架上，里面的内容可见。将另一根管子（用于细胞真皮）留在冰上。 从制冷中取出8毫克/mL胶原蛋白，放在湿冰上。注意：不要使用冰柜冰或-20°C台式冷却器，因为这将冻结胶原蛋白。 在冷盖管中，加入 516 μL 的介质，并立即使用 1000 μL 正位移移液器添加 375 μL 的冷胶原蛋白。将胶原蛋白分配到溶液中（而不是到管子的一侧）。立即取出空移液器尖端，切换到准备好的 250 μL 正位移移器进行混合。 快速但轻轻地混合以防止气泡形成，如果可能，不要从溶液中去除尖端。混合，直到溶液是同质的颜色，这通常需要约5个移液器周期或10s（如果使用媒体与苯酚红色，颜色将变得更轻，统一）。混合时，请务必从管子的不同位置（底部和顶部）提取，以便进行均匀混合。注意：这可以用516μL的细胞培养级水或其他细胞培养级液体进行，然而，大多数介质的苯酚红色是混合的良好指标。使用用于 2D 扩展的成纤维细胞或内皮介质。 立即将 125 μL 的细胞胶原蛋白分散到三个 12 井培养基插入物的膜上。为了确保细胞胶原蛋白凝胶的均匀覆盖，摇动菜：如果不能创建均匀的膜覆盖，则使用移液器尖端通过轻轻将胶原蛋白周围扩散来绘制膜;避免对膜施加压力。凝胶几乎立即开始：快速执行此步骤，以确保均匀覆盖。注意：会有多余的细胞胶原蛋白。体积可以减少，但是，准备少于1mL的胶原蛋白悬浮会导致溶液混合困难和凝胶不足。 立即将12井板移到37°C细胞培养孵化器，使其凝胶至少20分钟（如果需要，细胞胶原蛋白可以凝胶更长的时间;在此凝胶时间，继续步骤2.2）。从冰中取出胶原蛋白悬浮，重新放入制冷（胶原蛋白在 4 °C 时最稳定）。 细胞悬架和播种准备注：对于此协议的文化时间表，这相当于潜水日 1 （SD1） 在凝胶的乙酰胶原蛋白支持，尝试脱脂和计数内皮和成纤维细胞系。 在各自介质的 258 μL 中悬浮 7.5 x10 5 5 内皮细胞和 7.5 x10 4 成纤维细胞，并结合细胞悬架创建 516 μL aliquot。在湿冰上保持细胞悬架，直到使用。 准备 1000 和 250 μL 正位移移液器，供使用并预留。由于后一步对时间敏感，因此加载移液器提示和设置体积（分别为 375 μL 和 250 μL）非常方便。此外，为 516 μL 设置一个正常的 1000 μL 移液器。 皮肤隔间的细胞载胶原蛋白播种 凝胶期后，从孵化器中取出12个井板的细胞胶原蛋白。注意：如果这种胶原蛋白在 30 分钟后未凝胶，请不要继续操作，因为播种过程中可能存在错误或胶原蛋白库存可能有问题（请参阅讨论中的故障排除）。 从湿冰中取出 1.7 mL 盖管（包含 10 倍 PBS 和 NaOH）。将管子放在架子上，以便对内容可见。松开/打开所有盖子（细胞悬架、冷盖管）。 从 4 °C 制冷中取出库存胶原蛋白 （8 毫克/mL），并将其放置在湿冰上。打开盖。 将 516 μL 的冷却细胞悬架添加到冷盖管中。使用 1000 μL 正位移移移液器，立即将 375 μL 的冷胶原蛋白溶液直接放入封顶管的溶液中。 将所有胶原蛋白从移液器中排出到管中，并丢弃正位移移器尖端。立即切换到 250 μL 正位移移液，并混合胶原蛋白溶液。 混合胶原蛋白溶液，如以前完成（快速但轻轻地防止气泡形成），如果可能，不要从凝胶中取出尖端。混合，直到溶液是同质的（约5个移液器周期或10s）。混合时，一定要从管子的不同位置（底部和顶部）提取，以便均匀混合。 混合后，立即将 250 μL 的细胞胶原蛋白溶液转移到三个 12 井培养基插入物中的乙酰胶原蛋白支架上。为了确保细胞胶原蛋白支持的均匀覆盖，摇动菜和/或使用正位移移液器在不干扰细胞层的情况下轻轻移动新播种的细胞胶原蛋白。 立即将 12 井板移动至 37 °C 细胞培养孵化器，使其凝胶至少 30 分钟。使用后将胶原蛋白放回4°C制冷。 30分钟凝胶时间后，轻轻倾斜板来评估凝胶。确保胶原蛋白凝固。 分别在插入的上腔室和下腔中加入 500 μL 和 1000 μL 的混合介质（半内皮和半成纤维细胞维护介质）（先上，后下，以防止静水压力将胶原蛋白向上推）。将介质缓慢地添加到井边，而不是直接添加到胶原蛋白凝胶上，以尽量减少胶原蛋白的破坏。 确保胶原蛋白凝胶被淹没，如有必要，添加更多介质。将井板放在细胞孵化器中进行隔夜孵化。在这个阶段，媒体包含10%的FBS：每个细胞系的正常维护介质（图1中给出的时间线和示意图，A）。注：VHSE 文化的媒体可以适应自定义细胞类型：可能需要进行一些优化。 淹没日 2 （SD2） 媒体变化 将 VHSE 井中的 10% FBS 介质更改为 5% FBS 半成纤维细胞，半内皮介质辅以 100μg/mL L-阿斯科尔比酸。将 500 μL 添加到井侧的培养物插入的上腔（再次，小心地添加到侧壁，以尽量减少胶原蛋白的破坏），并将 1000 μL 添加到下腔室。 每 2 天更新一次媒体 （SD4 和 SD6）， 直到淹没日 7 （SD7） 。 使用手动移液器从井中去除介质。使用吸气器是可能的，但可能导致构造的损坏或破坏。注意：L-抗氧酸必须每2-3天新鲜一次（它在溶液中氧化以产生过氧化氢，从而产生氧化应激，并最终造成细胞损伤53）。因此，由于存在 L-抗酸，因此必须每 2-3 天更换一次 SD2 至 VHSE 文化结束的媒体。最容易制作媒体库存，并在每天喂食时向媒体添加新鲜准备的 L-抗酸量。使用培养品位水或介质作为溶剂，在100毫克/毫升下准备新鲜的L-抗酸。L-抗曲酸以适当的速度通过成纤维细胞刺激胶原蛋白合成，促进胶原蛋白稳定性54、55、56：它还降低了内皮渗透性，保持了船壁的完整性56，57，并进一步有助于表皮屏障形成6，58。 3. 表皮成分和分层感应的播种 潜水日 7 （SD7）： 种子角蛋白细胞注：种子角蛋白细胞，以建立SD7上的表皮。这个时间点可以根据研究人员的需要进行移动。没有角蛋白细胞的浸入培养的持续时间不应超过9天，因为更长的浸入通常会导致皮肤收缩增加。如果收缩发生在 SD7 之前，建议将浸入期缩短到 5 天，并在 SD5 上进行种子表皮。根据特定实验的要求优化浸入期（请参阅讨论中的故障排除）。 培养角蛋白细胞（N/TERT-120，59或其他适当的细胞）到它们的共性限制之前尝试胰蛋白和播种到VHSEs。对于N/TERT-1细胞，共聚性不应显著超过30%，以防止在2D培养59中角蛋白细胞的不想要的分化。对于其他适当的细胞系，如原发性人类表皮角蛋白细胞，一般使用60的共量限制75-80%。 尝试脱脂后，在600μL的人类皮肤等价物（HSE）分化介质中计数并暂停510，000个细胞，并辅以5S（表1）。注：600 μL 中的 510，000 个细胞允许在每个构造播种 200 μL（3 VHSEs） 时允许 170，000 个细胞/构造。 使用手动移液器，收集和丢弃目前在底部和顶部室的介质，为每个构造井。一定要收集尽可能多的媒体。通过轻轻地将移液器尖端置于培养物插入膜下，并暂时将插入物敲出位置，收集可能直接卡在透气膜下的介质。媒体可能因为表面张力而卡住。在继续之前，请确保插入物平放在井中。使用吸气器是可能的，但可能导致构造的损坏或破坏。 将 1 毫升的 HSE 介质添加到每口油井的下腔，并辅以 5% FBS。然后将 200 μL 的细胞悬浮添加到每个油井的顶室中。种子直接进入皮肤构造表面。让角蛋白细胞在孵化器中沉淀2小时。 播种角蛋白细胞后，小心地将 300 μL 的 HSE 介质补充为 5% FBS 到每个构造井的顶室：慢慢地移液器介质到文化插入侧面。将介质非常小心地加载到顶室，以免干扰可能尚未紧密粘附在底层胶原蛋白凝胶上的固定角蛋白细胞。 加载介质后，将构建重新放入孵化器中。 潜水日 8/9 （SD8 或 SD9） 组成 HSE 介质，辅以 1% FBS 和 100μg/mL L 抗酸。 用手动移液器从上下腔室中去除介质。 先将 500 μL 介质添加到顶室，然后将 1 mL 添加到底室中。（此步骤可在 SD8 或 SD9 上完成） 淹没日 9/10 （SD9 或 SD10，这应该是步骤 3.2 后的第二天） 用100微克/毫升L-抗酸组成无血清HSE分化介质。 用手动移液器从上下腔室中去除介质。 将 500 μL 加载到上腔室，在下腔室中加载 1 mL。 空气-液体接口第1天（ALI1）注：ALI 执行步骤 3.3 后的第二天。 仅通过从上腔中去除介质废物，将每个构造提升为空气液体接口 （ALI）。使用手动移液器尽可能靠近表皮层，而不会接触或损坏表皮层。 将盘子稍微倾斜不同角度以收集介质。在此步骤中删除尽可能多的媒体。在板内的周围井中加入约2mL的无菌水，以保持一致的湿度：在整个文化中保持充满水的水井。 稍后检查板，以确保角蛋白细胞仍位于空气液体接口。如果上腔有介质，则将其删除。跟踪每个 VHSE 井的移除介质量（上下腔室的初始体积 （1500 μL） – 移除的介质 = ALI 馈送的良好起点）。注：VHSEs 不一定要求相同的媒体水平进行空运：通常，如果VHSEs是一起播种的，那么他们需要大约相同水平的媒体进行空运，但情况并非总是如此。根据需要调整音量以保持 ALI，但确保介质级别不会太低，以使 VHSEs 干涸。在达到空运和水化之间的平衡之前，谨慎行事并每天去除少量介质更安全。 阿里日 2 （阿里 2） 从此，仅使用血清免费 HSE 介质，并辅以 100 微克/毫升 L-抗酸。在 ALI 第 2 天 （ALI2） 更改媒体。如果顶部腔室中有介质，则将其删除并添加到之前记录的已删除的介质量中。使用上一步的方程计算所需的媒体量。例如：如果从上腔中去除 200 μL 的介质，则添加 1300 μL 以建立 ALI（如 1500 μL – 200 μL = 1300 μL） 使用计算的体积加载到每个油井的底部腔室，然后将板放回细胞孵化器中。跟踪每天使用的音量。在 12 井培养物中使用推荐的胶原蛋白量时，通常的 ALI 值范围在 750 μL 和 1300 μL 之间。 通常，音量会随着文化成熟而减少，并在 ALI 的第 2/3 周左右保持一致。根据文化细节，此数字可能会发生变化，并且必须进行优化（如 3.4.2 – 4.1 所述）。 4. 血管人体皮肤等价物的常规维护 从 ALI 第 3 天 （ALI3） 到文化终点：每 2-3 天使用 100 微克/毫升 L-抗酸的无血清 HSE 介质更新下腔介质。继续调整和跟踪第 3.5.2 步中描述的 ALI 底部腔室所需的介质级别。 由于表皮表面必须与空气保持接触，因此每天检查和调整介质水平，直到确定一致的 ALI 水平。表皮层应看起来水合，而不是干燥，但不应有介质汇集在结构顶部。具有8周ALI的文化提供了最一致的形态和表达：但是，根据应用的不同，4 至 12 周的文化可能是适当的。可能需要优化不同细胞和文化条件的文化持续时间。注：周一、周三、周五更换媒体是一个很好的做法。VHSEs 在周末很健康，但媒体应该在周一早，周五晚些时候更换。在完全完成步骤 1-4 后，VHSE 的生成完成。协议的第 5 步是可选的处理和成像技术，这些技术已针对此类 3D 构造进行了优化。 5. 3D 构造的固定和渗透 注：步骤 5 已优化为该 3D 构造特定的成像技术，该技术在协议的其余部分中概述。生成 VHSE 不需要以下步骤。 固定/渗透 在文化时期的末点，小心地从每个井的上下室中删除所有介质。注意：表皮层可能是脆弱的，小心处理，不要用攻击性管道搅动表皮。 在 PBS （pH 6.9） 中加入 4% 的副甲醛 （PFA） 到上腔壁（不直接在构造上），然后添加到下腔室，以预先修复每个构造。每室加1毫升，在室温下暴露5分钟。注意：PFA 是危险的，应小心处理和适当的个人防护设备 （PPE），包括眼睛保护。 5 分钟后删除 4% PFA 解决方案，并在 4% PFA 解决方案中加入 0.5% Triton X 100，如上一步所述。在室温下暴露1小时;从现在起，VHSE 结构不需要无菌环境。 1 小时后，小心地从两个腔室中取出渗透/固定溶液，用 1 倍 PBS 清洗样品 3 次。 将样品存放在 PBS 中，以 4 °C 制冷或立即污渍。要存储样品，将盘子包裹在塑料包装中，然后用铝箔将蒸发和光线照射降至最低注意：暂停点 – 固定和渗透后，此程序可以暂停，因为样品稳定数周，如果按照步骤 5.1.5 中概述的准备。或者，污渍（如第 6 步所述）可在第 5 步之后立即完成。 6. 3D 构造的免疫荧光染色 构造准备注意：VHSEs 与文化插入的多孔膜分离时污渍良好：从膜分离也是无阻塞成像的必要，并使染色体积减少。 要准备免疫荧光染色结构，请倒置插入物，并将其放在井板上的井上（如果 VHSE 掉落，它将与 PBS 一起掉入井中）（补充图 1A）。 用一只手在井上稳定插入物，同时使用细尖钳和/或精密刀切开插入膜约一半的周长。用温柔的手尽可能靠近塑料外壳，以防止 VHSE 构造损坏。 使用细尖钳，抓住切膜皮瓣的边缘，轻轻剥去插入物和 VHSE 构造上的多孔膜。非常小心和缓慢地这样做，以防止 VHSE 构造结构损坏。如果 VHSE 构造很容易分离，那么它应该掉到下面的井里，如果它卡在腔室的一侧，然后使用细尖钳或一个小勺子将其移动到井中。非常注意表皮层，因为它通常是脆弱的（补充图1A）。注意：有时膜不会轻易脱落或成片脱落，如果发生这种情况，请使用工具小心地将膜和 VHSE 构造分开。如有必要，请通过浸入 PBS，确保 VHSEs 在此过程中不会干涸。 一旦 VHSE 进入井中，丢弃插入膜的任何剩余部分，并将培养物插入每个井中，以便在染色过程中将 VHSE 置于水下位置。 染色注意：由于 VHSEs 可能很脆弱，因此应尽可能轻轻地进行染色和相关处理/操作和洗涤。如果表皮部分脱落，可以单独染色：表皮的上层是脆弱的，经历自然脱毛4，但对于分析，重要的是保持完整性尽可能多。 在每个构造井的阻塞缓冲区 700 μL 中准备所选的主要抗体污渍（通常，所有主要抗体都可以在同一染色溶液中，但应确认为新的抗体）。700 μL 适用于 12 井大小，但可以根据其他文化格式进行调整。建议浓度的初级和次生抗体与阻塞缓冲配方在 表3（ 可能需要优化）。 使用手动移液器从井中取出任何 PBS，小心移液器远离 VHSEs（由于 VHSEs 是浮动的，不建议使用真空吸气）。 将主要污渍溶液添加到每口油井中，并将培养物插入井中，以保持 VHSE 浸入液体中（补充图 1B）。用塑料包装井板。在 4 °C 制冷中，在 4°C 制冷时，箔和污渍可保持 48 小时，而不会搅拌或摇晃（摇晃可能会损坏 VHSE 构造）。 48 小时后，在 700 μL 阻塞缓冲区（每口井）中准备二次抗体和化学污渍。 在添加辅助污渍溶液之前，取出培养物插入外壳和主污渍溶液，用 1 倍 PBS 清洗，3 次洗涤 5 分钟。将文化插入房屋回井，以保持VHSE结构淹没（补充图1B）。在 4 °C 制冷中暴露 48 小时，无需搅拌或摇动。 48 h 曝光后，用手动移液器取出污渍溶液，用 PBS 轻轻洗 3 次：不要将移液液直接输送到VHSEs上，因为它们可能是脆弱的。用多余的 PBS 补充水分，并将培养物插入回井中，以保持储油过程中 VHSE 的水下和水分（通过用塑料包装和铝箔储存，以尽量减少蒸发和光线照射） 结算（可选和终端）注：结算可选用于成像。如果完成，它应该做染色/成像样品完全，因为清除防止进一步染色，可能会改变氟化物性能，并可能损坏VHSE结构。存在多种组织清除方法49、61、62，可针对特定项目进行优化。甲基水杨酸盐清除，如下所述，是简单和有效的VHSE。以下清除技术必须在玻璃容器中完成，移液器尖端必须是玻璃或聚丙烯（聚苯乙烯会与甲基水杨酸盐接触溶解）。在通风良好的区域或烟气罩中完成所有清除程序。 在小型浅玻璃容器中加入 100% 甲醇（玻璃培养皿效果良好）。使用适合构造的最小容器（以尽量减少试剂废物）。 使用钳子/勺子（补充图1C）从井板上取出构造，并放置在甲醇填充容器中。如果构造未被淹没，则添加更多甲醇。 脱水VHSE构造在甲醇3×10分钟浸泡：每次浸泡后完全更换甲醇，并在上次洗澡后及时去除甲醇。在此过程中，构造可能会变得更加不透明，并略有收缩。注意：这些持续时间和重复已优化，但甲醇和以下甲基水杨酸盐程序可能需要根据特定的文化格式和污渍进行定制。 去除甲醇后，立即加入甲基水杨酸盐，并在5×5分钟内浸入VHSE。每次浸入后完全更换试剂，并将 VHSE 留在第 5 个浸入式解决方案中以进行存储。在此过程中，构造变得透明。 将构造或存储在 4 °C 进行映像。 清除后，尽快完成所有成像，因为氟磷可能在几天内在甲基水杨酸盐中降解。清除会导致构造变得脆，虽然不建议扩展存储，但需要定期检查，以确保甲基水杨酸盐量充足。 7. 3D 构造的共聚焦成像 注意：通过组织培养塑料成像不会产生与通过盖片玻璃成像相同的图像质量，此方法描述定制玻璃底井的制造，以防止在共焦成像过程中干燥。通常，这足以进行至少 3 小时的成像。 成像前两天：准备多晶硅氧烷 （PDMS） 准备 PDMS48，63，64在建议浓度 [9：1]， 基础： 交联器.准备 30 g PDMS 总计：27 克基础组件和 3 克交联器。将任何干净的混合容器放在称重平衡上，并擦干秤。添加基座（27克），然后添加交叉链接器（3克），以实现总共30克。始终在交联之前添加基座。 大力搅拌溶液至少4分钟：这将产生小气泡。充分混合后，将 PDMS 倒入 100 毫米培养皿中，或类似的平底耐热容器中。 在真空室中去气 PDMS，直到混合产生的所有气泡消失，PDMS 清晰。缓慢释放真空并（缓慢）去除 PDMS。将菜放入烤箱过夜（50-60 °C）：确保菜是平的，PDMS均匀地治愈。注意：固化后，PDMS 应清晰，表面应光滑且不粘（粘性可能表示混合不足）。 成像前一天：PDMS 准备充分 使用钢冲床或手持精密刀，从 7.1 中准备的 PDMS 板中冲出或切出圆形井。油井的大小应与 VHSE 构造大致相同。在圆形油井周围切一个方形补丁，以创建一个单个 PDMS 井。准备的 30 克 PDMS 量应至少产生四口定制井。注：PDMS 井必须接近 VHSE 构造的大小。在成像过程中，它必须限制样本运动。多个油井可以同时制造，并无限期地储存在干净的容器中。 使用与 PDMS 井大小相近的玻璃盖片，将氰丙烯酸胶（例如超级胶水）添加到 PDMS 的底部表面（与培养皿接触的光滑表面），并用一次性移液器尖均匀涂抹。将 PDMS 按到玻璃上，同时在打孔的圆圈内留下一个透明的玻璃窗（确保胶水不会涂抹在观看窗口上）。注：如果可用，PDMS与盖片的等离子粘接是替代65，66，67。 使用前，让胶水干燥数小时或过夜。这些是可重复使用的，直到它们打破正常的磨损。注意：不建议将粘合的 PDMS 中的样品染色，这些样品用于成像。这些油井保持液体几个小时，但在较长的染色过程中可能会泄漏。 VHSE 成像注意：如果成像未清除样品，请使用 PBS 作为成像解决方案。如果成像与清除的样品，使用甲基水杨酸盐（或选定的清除解决方案）作为成像解决方案。 将几滴成像溶液添加到 PDMS 井中，并检查是否有泄漏（如果有泄漏，请用氰酸酯超级胶水点/涂抹修复或使用另一口井）。 添加 VHSE 时，请将成像解决方案保存在 PDMS 中。使用勺子或细尖钳（补充图1C），从12井板中取出构造，放入PDMS井到玻璃盖上。以利益取向面向目标的地方建设。例如，使用倒置显微镜对表皮进行成像，请确保表皮朝下朝下朝玻璃。 或者，对于直立显微镜，要面对表皮向上。以下成像程序用于倒显微镜，但可以很容易地适应直立。注意：在操作 VHSE 时要小心以避免损坏。转移井板，以防VHSE掉落。弯曲，扁平的尖端铲是最简单的方法来转移构造（补充图1C）。 确保样品平放在井中，并且表皮或真皮部分不会折叠在样品下。如果发生折叠，用钳子或勺子轻轻操纵样品：暂时添加额外的成像解决方案以浮动 VHSE 可能会帮助它理顺。可以通过眼睛或显微镜看到样品的折叠或皱纹。 用成像溶液填充油井，使用足够的液体来保持样品水分：过多的液体会漂浮样品，导致成像过程中的运动。构造应位于玻璃观景窗上：通过倾斜PDMS来测试运动。如果有运动，取出一些液体：明智地添加和去除液体滴落，直到运动停止。 在井上放置玻璃滑梯，以尽量减少成像过程中的蒸发（补充图1D）。对于更长的成像会话，请经常检查样本，以确保适当的流体水平。如果可访问，可以在成像过程中使用加湿室（尽管通常没有必要）。 将样品放在显微镜舞台上，并通过玻璃盖片窗口（补充图1D）放置图像。此技术允许至少 3 小时的连续共焦成像，但应定期检查样品的水化情况，必要时添加成像解决方案。注意：如果样品被清除，甲基水杨酸盐会随着时间的推移降低胶水。PDMS 粘合的胶水可以在成像运行之间重新应用：或者样品可以定期转移到新井。在有等离子粘接的油井中，这不会是问题。 成像后，将样品尽可能多地用成像液漂浮在井中。使用勺子或细尖钳将样品转移到其存储井中。在样品掉落时，在井板上进行转移。 每个 PDMS 井和顶部玻璃盖片都可以重复使用，直到它们断裂。在成像前清洁井底玻璃，无论是井内还是井外。在重复使用之前，请务必检查泄漏，并在必要时用胶水进行修复。 存储步骤 6.3.6 中描述的样本，并每隔几个月添加 PBS 以维护;如果样品被清除，使用甲基水杨酸盐储存在玻璃中，并定期检查水平。清除的样品可能会迅速降解（在几天内），并应尽快成像。