تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic
Summary
سيسمح بروتوكول التجزئة هذا للباحثين بعزل البروتينات السيتوبلازمية والنووية والميتوكوندريا والأغشية من خلايا الثدييات. يتم تنقية الجزأين الأخيرين تحت الخليتين بشكل أكبر عبر تدرج كثافة isopycnic.
Abstract
يصف هذا البروتوكول طريقة للحصول على أجزاء البروتين تحت الخلوي من خلايا الثدييات باستخدام مزيج من المنظفات والتحلل الميكانيكي والطرد المركزي المتدرج لكثافة isopycnic. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه لا يعتمد على الاستخدام الوحيد للمنظفات الذائبة للحصول على كسور تحت خلوية. هذا يجعل من الممكن فصل غشاء البلازما عن عضيات الخلية الأخرى المرتبطة بالغشاء. سيسهل هذا الإجراء تحديد توطين البروتين في الخلايا بطريقة قابلة للتكرار وقابلة للتطوير وانتقائية. تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لعزل بروتينات الغشاء الخلوي والنووي والميتوكوندريا والبلازما من خط الخلايا الأحادية البشرية ، U937. على الرغم من أنه تم تحسينه لخط الخلية هذا ، إلا أن هذا الإجراء قد يكون بمثابة نقطة انطلاق مناسبة للتجزئة تحت الخلوية لخطوط الخلايا الأخرى. تتم مناقشة المزالق المحتملة للإجراء وكيفية تجنبها وكذلك التعديلات التي قد تحتاج إلى النظر في خطوط الخلايا الأخرى.
Introduction
التجزئة تحت الخلوية هي إجراء يتم فيه تحليل الخلايا وفصلها إلى مكوناتها المكونة من خلال عدة طرق. يمكن استخدام هذه التقنية من قبل الباحثين لتحديد توطين البروتين في خلايا الثدييات أو لإثراء البروتينات منخفضة الوفرة التي لا يمكن اكتشافها بخلاف ذلك. في حين أن طرق التجزئة تحت الخلوية موجودة حاليا ، وكذلك المجموعات التجارية التي يمكن شراؤها ، فإنها تعاني من العديد من القيود التي يحاول هذا الإجراء التغلب عليها. تعتمد معظم طرق تجزئة الخلايا حصريا على المنظفات 1,2 ، وتعتمد على استخدام مخازن مؤقتة تحتوي على كميات متزايدة من المنظفات لإذابة المكونات الخلوية المختلفة. في حين أن هذه الطريقة سريعة ومريحة ، إلا أنها تنتج كسورا غير نقية. تم تصميم هذه للسماح للباحثين بعزل واحد أو اثنين من مكونات الخلية بسهولة ، ولكنها ليست معقدة بما يكفي لعزل أجزاء متعددة تحت الخلوية من عينة في نفس الوقت. عادة ما يؤدي الاعتماد فقط على المنظفات إلى إذابة عضيات مغلقة بالغشاء وغشاء البلازما بشكل عشوائي ، مما يجعل فصل هذه المكونات أمرا صعبا. ومن المضاعفات الإضافية الناجمة عن استخدام هذه المجموعات عدم قدرة الباحثين على تغييرها / تحسينها لتطبيقات محددة ، حيث أن معظم المكونات عبارة عن تركيبات مسجلة الملكية. أخيرا ، يمكن أن تكون هذه المجموعات باهظة الثمن ، مع وجود قيود في عدد الاستخدامات تجعلها أقل من مثالية للعينات الأكبر.
على الرغم من توفر مجموعات لعزل الميتوكوندريا التي لا تعتمد على المنظفات ، إلا أنها ليست مصممة لعزل غشاء البلازما وإنتاج كميات أقل بكثير من العينة من بروتوكولات العزل القياسية 3,4. في حين أن طرق الطرد المركزي التفاضلية تستغرق وقتا أطول ، فإنها غالبا ما تؤدي إلى كسور مميزة لا يمكن الحصول عليها باستخدام مجموعات قائمة على المنظفاتحصريا 1. يسمح الفصل دون الاستخدام الوحيد للمنظفات القابلة للذوبان أيضا بمزيد من التنقية باستخدام الطرد المركزي الفائق وتدرجات كثافة isopycnic ، مما يؤدي إلى تلوث أقل تبادليا. يوضح بروتوكول التجزئة هذا عزل الأجزاء تحت الخلوية من وحيدات U937 باستخدام مزيج من الأساليب القائمة على المنظفات والطرد المركزي عالي السرعة. ستسهل هذه الطريقة عزل مكونات الغشاء النووي والسيتوبلازمي والميتوكوندريا والبلازما لخلية الثدييات مع الحد الأدنى من التلوث بين الكسور.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الطريقة هي نسخة معدلة من نهج منشور مسبقا للتجزئة تحت الخلوية دون استخدام الطرد المركزي عالي السرعة11. تتطلب هذه الطريقة المعدلة معدات أكثر تخصصا لتحقيق أفضل النتائج ، ولكنها أكثر شمولا وقابلة للتكرار باستمرار.
كان تطوير البروتوكول الأولي ضروريا بسبب عدم ال…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل NIH R15-HL135675-01 و NIH 2 R15-HL135675-02 إلى T.J.L.
Materials
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
| refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
| S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicator | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
| Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
Referenzen
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
- Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
- McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
- McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
