Fractionnement cellulaire de cellules U937 par purification par gradient de densité isopycnique
Summary
Ce protocole de fractionnement permettra aux chercheurs d’isoler des protéines cytoplasmiques, nucléaires, mitochondriales et membranaires à partir de cellules de mammifères. Les deux dernières fractions subcellulaires sont purifiées par gradient de densité isopycnique.
Abstract
Ce protocole décrit une méthode pour obtenir des fractions protéiques subcellulaires à partir de cellules de mammifères en utilisant une combinaison de détergents, de lyse mécanique et de centrifugation à gradient de densité isopycnique. L’avantage majeur de cette procédure est qu’elle ne repose pas sur l’utilisation exclusive de détergents solubilisants pour obtenir des fractions subcellulaires. Cela permet de séparer la membrane plasmique des autres organites liés à la membrane de la cellule. Cette procédure facilitera la détermination de la localisation des protéines dans les cellules avec une méthode reproductible, évolutive et sélective. Cette méthode a été utilisée avec succès pour isoler les protéines cytosoliques, nucléaires, mitochondriales et plasmiques de la lignée cellulaire monocytaire humaine, U937. Bien qu’optimisée pour cette lignée cellulaire, cette procédure peut servir de point de départ approprié pour le fractionnement subcellulaire d’autres lignées cellulaires. Les pièges potentiels de la procédure et la façon de les éviter sont discutés, tout comme les modifications qui peuvent devoir être envisagées pour d’autres lignées cellulaires.
Introduction
Le fractionnement subcellulaire est une procédure dans laquelle les cellules sont lysées et séparées en leurs composants constitutifs par plusieurs méthodes. Cette technique peut être utilisée par les chercheurs pour déterminer la localisation des protéines dans les cellules de mammifères ou pour enrichir des protéines de faible abondance qui seraient autrement indétectables. Bien qu’il existe actuellement des méthodes de fractionnement subcellulaire, tout comme les kits commerciaux qui peuvent être achetés, ils souffrent de plusieurs limitations que cette procédure tente de surmonter. La plupart des méthodes de fractionnement cellulaire sont exclusivement à base de détergent1,2, reposant sur l’utilisation de tampons contenant des quantités croissantes de détergent pour solubiliser différents composants cellulaires. Bien que cette méthode soit rapide et pratique, elle aboutit à des fractions impures. Ceux-ci sont conçus pour permettre aux chercheurs d’isoler facilement un ou deux composants de la cellule, mais ne sont pas assez complexes pour isoler plusieurs fractions subcellulaires d’un échantillon en même temps. Se fier uniquement aux détergents entraîne généralement une solubilisation indiscriminée des organites enfermés dans la membrane et de la membrane plasmique, ce qui rend la séparation de ces composants difficile. Une complication supplémentaire de l’utilisation de ces kits est l’incapacité des chercheurs à les modifier/optimiser pour des applications spécifiques, car la plupart des composants sont des formulations exclusives. Enfin, ces kits peuvent être d’un coût prohibitif, avec des limites dans le nombre d’utilisations qui les rendent moins qu’idéaux pour des échantillons plus volumineux.
Malgré la disponibilité de kits pour l’isolement des mitochondries qui ne dépendent pas de détergents, ils ne sont pas conçus pour isoler la membrane plasmique et produire des quantités d’échantillon significativement inférieures aux protocoles d’isolement standard 3,4. Bien que les méthodes de centrifugation différentielle prennent plus de temps, elles aboutissent souvent à des fractions distinctes qui ne peuvent pas être obtenues avec des kits exclusivement à base de détergent1. La séparation sans utilisation exclusive de détergents solubilisants permet également une purification supplémentaire à l’aide d’ultracentrifugation et de gradients de densité isopycnique, ce qui réduit la contamination croisée. Ce protocole de fractionnement démontre l’isolement de fractions subcellulaires à partir de monocytes U937 en utilisant une combinaison d’approches basées sur la centrifugation à haute vitesse et les détergents. Cette méthode facilitera l’isolement des composants nucléaires, cytoplasmiques, mitochondriaux et plasmiques d’une cellule de mammifère avec une contamination minimale entre les fractions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode est une version modifiée d’une approche précédemment publiée du fractionnement subcellulaire sans l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse11. Cette méthode modifiée nécessite un équipement plus spécialisé pour obtenir les meilleurs résultats, mais elle est plus complète et reproductible de façon cohérente.
Le développement du protocole initial était nécessaire en raison de l’incapacité de séparer les échantillons mito…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIH R15-HL135675-01 et NIH 2 R15-HL135675-02 à T.J.L.
Materials
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
| refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
| S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicator | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
| Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
Referenzen
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