신생아 마우스 심장 대식세포를 성인 마우스로 이식

모든 실험은 실험실 동물의 사용 및 관리를위한 가이드에 따라 수행되었다. 모든 동물 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), 후와이 병원, 중국 의학 과학 아카데미에 의해 승인되었다. 무균 기술은 수술 부위의 오염을 방지하기 위해 절차 전반에 걸쳐 필요합니다. 1. 신생아 1 일 Cx3cr1 GFP / + 마우스(C57BL / 6 배경)에서 에피칼 절제술 작업 마취 모든 마우스 새끼를 케이지에서 꺼내 깨끗한 드라이 박스에 넣습니다. 각 마우스를 얼음에 약 2-3분 동안 포함시킴을 가했습니다. 동상을 방지하기 위해 얼음과 마우스 새끼 사이에 라텍스 또는 거즈와 같은 얇은 장벽이 있는지 확인하십시오. 창백한 피부, 사지 운동 부족, 페달 반사 부족 등 다음과 같은 징후를 관찰하여 충분한 마취를 식별합니다. 소라코토미 마취를 유지하기 위해 -20 °C에서 하룻밤 동안 청동 작동 플랫폼을 미리 식힙. 마취 된 마우스를 얼음 상자에서 꺼내 청동 작동 플랫폼에 놓습니다. 수술 플랫폼에 마우스를 의료 용 접착제 테이프를 사용하여 supine 위치에 고정하십시오. 고정 관상 아래에 마우스와 운영 플랫폼을 넣어. 베타딘에 담근 준비 패드와 70% 알코올 또는 제도적 정책과 일치하여 마우스 가슴을 소독하십시오. 가슴 구멍의 네 번째 늑간 영역에서 1cm 절단된 피부를 절인 다음 심장에 접근할 때까지 미세 수술 가위를 사용하여 늑간 근육을 분리합니다. 심장이 기계적 손상없이 가슴 밖으로 외부 될 때까지 두 개의 집게의 도움으로 가슴과 복부를 번갈아 누릅니다. 심장을 고정하기 위한 자연스러운 고정으로 작은 절개 아래와 위에 갈비뼈를 놓습니다. 심실 정점 절제술 좌심실의 정점을 찾습니다. 입체 현미경으로 iridectomy 가위를 사용하여 심실 정점 조직의 직경 1mm를 자른다. 왼쪽 심실 챔버가 노출되어 있는지 확인하고 스며들기 시작합니다. 면봉을 사용하여 심장을 가슴 구멍으로 부드럽게 누릅니다. 8-0을 사용하여 근육, 갈비뼈 및 피부를 봉합합니다. 프롤렌 봉합사. 조작 후 마우스를 철저히 청소하십시오. 수술 후 관리 수술 플랫폼에서 마우스를 37°C 가열 담요로 전송하여 수술 직후 몸을 따뜻하게 합니다. 자발적인 호흡 복원, 창백한 피부색에서 분홍색으로 변하는 피부, 팔다리의 움직임 등 다음과 같은 징후를 관찰하여 마우스의 아나바이오시스를 확인합니다. 수술된 마우스를 회복한 후 어머니에게 다시 가져가십시오. 필요한 경우 수술된 마우스를 어머니의 중첩 재료로 섞습니다.참고 : 한 번에 어머니에서 모든 1 일 된 새끼를 제거하고 모든 새끼가 복구 된 후 한 번에 모두 반환하는 것이 중요합니다. 2. 신생아 심장 대식세포 현탁액 준비 참고: 이러한 모든 실험 절차는 어두운 곳에서 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 신생아 Cx3cr1GFP /+ 마우스의 심장을 수확 1 일 후 정류 절제술 Cx3cr1GFP/+ 마우스를 정판 절제 후 하루 만에 안락사시합니다. 이산화탄소를 초과 사용하여 마우스를 순차적으로 참수하여 안락사를 적용하십시오. 가슴에서 심장을 꺼내 PBS와 함께 10cm 접시에 담그십시오. 혈관과 남은 결합 조직을 심실에서 잘라냅니다. 심장에서 멀리 오리큘러 부록과 유출 관을 잘라. 심장 박동을 중지 한 후, 마이크로 수술 가위를 사용하여 PBS 버퍼에서 1-2 mm3 조각으로 심장을 잘라(그림 2A). 신생아 마우스 심장 해리 수확된 심장 조직을 예열효소믹스(재료표)를함유한 튜브로 옮기고 튜브를 단단히 닫습니다. 튜브를 반전시키고 캡다운(그림2B)으로놓습니다. 신생아 심장 해리 프로그램(재료의 표)을 실행합니다. 프로그램이 완료된 후 해리소에서 튜브를 분리합니다. 튜브에 10% FBS로 7.5mL의 DMEM을 추가합니다. 서스펜션을 15mL 원심분리튜브(도2C)로필터링하고 이송한다. 세포 현탁액을 300 x g에서 5분간 원심분리합니다. 세포 용액 1mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 실온에서 2 분 동안 배양하십시오. 5-10mL의 PBS 버퍼를 서스펜션에 넣고 원심분리기를 300 x g에서 5분간 추가합니다. 10% FBS로 DMEM의 1mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 신생아 심장 대식세포 격리 FACS에 의해 GFP+ 신생아 심장 대식세포를 정렬합니다. 10% FBS를 가진 DMEM의 500 μL을 포함하는 멸균 관에 정렬된 대식세포를 수신합니다. GFP+ 대식세포(그림2D)를계산합니다. DMEM의 대식세포는 DMEM의 200 μL당 1 x 106 대식세포 농도에서 10% FBS로 대식대를 다시 일시 중단하여 나중에 주입합니다.참고: GFP+ 대식세포의 수는 한 신생아 (대략 1 x 105);에서작습니다. 따라서, 적어도 10 신생아는 각 성인 마우스 주입에 대한 충분한 대식세포를 얻기 위해 사용되어야한다. 3. 신생아 심장 대식세포 이식 좌측 전방 관상 동맥8의결찰에 의해 성인(6-8주 령) 남성 C57BL/6 마우스에 심근경색 수술을 수행한다. 작동된 마우스를 37°C 가열 담요에 놓아 복구할 때까지 넣습니다. 정맥정맥을 통해 수술 후(약 6시간 후) 극한성 성마우스에 1 x 106 GFP+ 신생아 심장 대식세포가 있는 DMEM 200 μL을 정맥주사한다. 마우스를 깨끗한 케이지로 다시 보냅니다. 4. 결과 평가 사출 효율 유효성 검사 수술된 마우스를 마취하고 심근 경색 수술 후 7일 이내에 심장을 수확한다. 미리 냉각된 PBS 버퍼에 심장을 담급니다. 심장 조직을 4% 폴리포름알데히드로 흔들어 실온에서 72시간 동안 수정합니다. 디메틸벤젠과 에탄올에서 심장 조직을 탈수합니다. 파라핀에 심장 조직을 삽입하고 5 μm의 두께로 섹션으로 슬라이스. 표준 면역 형광 염색 프로토콜1을수행한다. α 액틴을 사용하여 심근세포를 표시하십시오. 이식을 받는 심장에서 GFP+ 대식세포를 감지합니다. 표준 면역 형광 염색 프로토콜1을수행한다. α-액틴 및 pH3를 사용하여 각각 심근세포 및 세포 증식을 표시합니다(그림3A). 이식 후 심장 수리 평가 수술 후 한 달 후 작동 된 마우스에 에코카디그래피를 사용1. 좌심실 배출 분획 및 분수 단축을 상이한 그룹에서 비교하여 심장 기능을 분석한다(도3B). 수술된 마우스를 마취하고 심장을 수확합니다. 4.1.2-4.1.5 단계를 반복합니다. 마슨의 염색 프로토콜을 수행합니다. 대식세포 주입 후 경색 영역을 분석한다(도3C).