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Incorporação otimizada de Análogos de Ácido Graxo Alkynyl para a detecção de proteínas aciclantes gordurosas usando a Química do Clique

Published: April 09, 2021
doi:
10.3791/62107
, ,
1Department of Biology,University of Waterloo

Summary

O estudo da aciilação gordurosa tem implicações importantes nas interações e doenças das proteínas celulares. Apresentado aqui é um protocolo modificado para melhorar a detecção de química de cliques de proteínas acicladas gordurosas, que podem ser aplicadas em vários tipos celulares e combinadas com outros ensaios, incluindo perseguição de pulso e espectrometria de massa.

Abstract

A aciilação gordurosa, a adição covalente de ácidos graxos saturados a substratos proteicos, é importante na regulação de uma miríade de funções celulares, além de suas implicações em câncer e doenças neurodegenerativas. Desenvolvimentos recentes em métodos de detecção de aciilação gordurosa permitiram a detecção eficiente e não perigosa de proteínas aciclantes gordurosas, particularmente através do uso de química de cliques com rotulagem bio-ortogonal. No entanto, a detecção de química de cliques pode ser limitada pela solubilidade ruim e potenciais efeitos tóxicos de adicionar ácidos graxos de cadeia longa à cultura celular. Descrita aqui é uma abordagem de rotulagem com entrega otimizada usando ácidos graxos saponificados em combinação com BSA livre de ácidos graxos, bem como mídia delipidada, que pode melhorar a detecção de proteínas aciclantes difíceis de detectar. Este efeito foi mais pronunciado com o analógico alquilo-estearate, 17-ODYA, que tem sido o analógico de ácido graxo mais usado na detecção de química de cliques de proteínas acicladas. Essa modificação melhorará a incorporação celular e aumentará a sensibilidade à detecção de proteínas acicladas. Além disso, essa abordagem pode ser aplicada em uma variedade de tipos celulares e combinada com outros ensaios como análise de perseguição de pulso, rotulagem estável de isótopos com aminoácidos na cultura celular e espectrometria de massa para perfilação quantitativa de proteínas aciclatadas gordurosas.

Introduction

A aciilação gordurosa envolve a adição covalente de ácidos graxos às proteínas e é bem conhecida por sua importância na promoção de interações proteína-membrana, mas também tem sido demonstrada para promover interações proteína-proteína, alterações conformais e regular locais catalíticos de enzimas1,2,3, 4,5,6,7 . A acieração gordurosa emergiu como um potencial alvo de drogas em uma miríade de doenças, incluindo infecção, câncer, inflamação e neurodegeneração, onde interrupções na palmitoilação foram documentadas8,9,10,11,12,13. Isso tem sido impulsionado principalmente pelo desenvolvimento de novos métodos de detecção química, que permitiram a identificação em larga escala de alvos de proteína s-acylated.

A aciilação gordurosa pode incluir uma variedade de modificações envolvendo a adição covalente de ácidos graxos saturados e insaturados, mas normalmente se refere a N-myristoylation e S-cylation. N-myristoylation refere-se à adição de ácido mirístico às glicinas n-terminais, seja co-translacionadamente em polipeptídeos nascentes ou pós-tradução em glicinas N-terminais recém-expostas após o decote proteolítico2,14. N-myristoylation ocorre através de um vínculo irreversível meio. Por outro lado, a aciilação de S normalmente refere-se à adição reversível de ácidos graxos de cadeia longa aos resíduos de cisteína através de uma ligação de tioester. A forma mais comum desta modificação inclui a incorporação de palmitato e, portanto, é comumente referida como S-palmitoylation, ou simplesmente palmitoylation11,15. Em muitos aspectos, s-palmitoylation é semelhante à fosforilação. É dinâmico, enzimaticamente regulado, e prova ser altamente tratável.

Até a última década, o estudo da aciclização gordurosa era dificultado por métodos limitados de detecção, que exigiam ácidos graxos radioativos. Isso teve várias desvantagens, incluindo custo, questões de segurança e tempos de detecção muito longos. Tipicamente, foi utilizada palmitato tritado ou iodinado para a detecção de S-acylation16. Palmitato tritado exigia longos períodos de detecção com filme autordiografia, o que pode levar de semanas a meses. Enquanto os análogos de ácido graxo iodo encurtaram os tempos de detecção, ele apresentou um risco de segurança muito maior e exigiu um monitoramento próximo da tireoide dos experimentadores. Além disso, esses métodos não eram quantitativos, limitando, portanto, a capacidade de medir palmitoylation dinâmica, e também demorado para a configuração e limpeza devido aos equipamentos de proteção individual extra e monitoramento radioativo. Finalmente, os rótulos radioativos não eram adequados para estudos proteômicos e tipicamente limitados à baixa detecção de throughput de proteínas específicas de interesse. À medida que mais substratos foram detectados e, inevitavelmente, as enzimas que mediam cada modificação foram identificadas, ficou claro que novos métodos de detecção foram necessários17,18,19,20,21. Quase simultaneamente, surgiram vários novos métodos para a detecção de proteínas acicladas gordurosas. O primeiro explora a reversibilidade e a reatividade do vínculo thioester da Acitação S. O ensaio da troca aciila-biotina (ABE) substitui quimicamente a palmitato por biotina para posterior retirada de proteínas S-acylated usando contas de ágarose avidin e detecção direta por mancha ocidental22,23,24. Em seguida, foram desenvolvidas rotulagem bio-ortogonal de ácidos graxos e adição quimoseletiva a tags ou alças que incluíram o uso da ligadura Staudinger e a química do clique25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Finalmente, semelhante à ABE, a captura assistida por acicli- resina (RAC) substitui essencialmente locais S-acylated por contas de tiol-reativas para captura e detecção de proteínas S-acylated34,35. Juntos, os ensaios baseados em troca e química de cliques forneceram métodos mais eficientes e sensíveis de detecção de aciilação e purificação de afinidade para análise a jusante e, posteriormente, levaram à descoberta de milhares de proteínas S-acylated8,36.

O termo química de clique abrange um grupo de reações químicas, mas mais comumente se refere ao mecanismo de reação de cicregidade entre um grupo alquilo e um grupo azido27,28,37. Particularmente, no caso da aciilação gordurosa, a química do clique envolve a detecção de S-palmitoylation ou N-myristylation incorporando bio-ortogonal 16-carbono alkynyl-palmitate (ácido 15-hexadecynoico; 15-HDYA) ou o alquilo-myristate de 14 carbonos (ácido 13-tetradecynoico; 13-TDYA), respectivamente, em células para rotular proteínas endógenas mente acicladas28 . Após a lise celular e a imunoprecipitação da proteína de interesse, uma reação química de clique (ligação covalente entre uma alkyne e um azida) é realizada para ligar uma sonda de afinidade, tipicamente biotina, para detecção por blot28,37 ocidentais. Alternativamente, a química do clique pode ser realizada no total de proteínas de lise celular e aciclação gordurosa pode ser purificada afinidade para identificação por espectrometria de massa. A reação química do clique inicial com azido-biotina aumentou a seletividade e sensibilidade da detecção mais de um milhão de vezes em comparação com a radioatividade2. Outra vantagem da química do clique é que ela pode ser combinada com outros métodos clássicos de rotulagem, como a análise de rotatividade de proteínas usando azido-homoalanina para análise quantitativa38. Além disso, sondas fluorescentes podem ser usadas em vez de biotina ou outras sondas bioquímicas, como bandeiras ou etiquetas Myc, a fim de examinar a localização da proteína16,28,39.

Apesar da relativa facilidade de uso da química do clique, a detecção pode ser limitada pela baixa solubilidade e potencial toxicidade do uso de ácidos graxos livres de cadeia longa na cultura celular40. Em particular, apesar da preferência de palmitato durante a S-acylation para a maioria das proteínas, muitos estudos têm usado o estearato de 18 carbonos (ácido 17-octadecynoico – 17-ODYA) em vez de palmitato (15-HDYA) para detectar proteínas S-cylated devido à sua disponibilidade comercial e custo relativamente baixo. No entanto, o 17-ODYA é muito insolúvel e requer atenção especial ao ser usado. Além disso, a química do clique pode exigir alguma preparação e armazenamento de produtos químicos. Aqui, o protocolo descreve uma abordagem de rotulagem, que otimiza a entrega usando saponificação de ácidos graxos, entrega com BSA livre de ácidos graxos e soro bovino fetal delipidado (FBS) para aumentar a solubilidade e contornar potenciais efeitos tóxicos da adição de ácidos graxos livres às células28. Este método funciona em uma variedade de tipos de células e tem sido até mesmo usado em animais vivos28.

Protocol

1. Cultura celular Para complementar o DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) para cultura celular, adicione 10% de soro bovino fetal (FBS), 1x Penicilina-Streptomicina, 2 mM L-glutamina e piruvato de sódio de 100 mM (1% vol/vol). Placa aproximadamente 5 x 105 células HEK293T/poço de um prato de cultura de tecido de 6 poços e cresça por 18 h em uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2 para atingir 75%-80% de confluência. Privação de soro de ácido graxo Para preparar a mídia de rotulagem, prepare o DMEM como acima (passo 1.1) sem 10% de FBS. Substitua a FBS por FBS revestido de carvão de 5% de carvão vegetal (DCC-FBS). Pré-aqueça até 37 °C antes de usar. Lave suavemente as células com 1x de salina tamponada de fosfato (PBS) à temperatura ambiente e substitua-se por mídia de rotulagem.NOTA: As células HEK293T se desprendem facilmente das placas de cultura tecidual. Tome cuidado ao lavar células e substituir a mídia. Minimize a agitação durante a transferência de e para a incubadora o máximo possível. Devolva as células à incubadora de 37 °C com 5% de CO2 e incubar aproximadamente 45 min (mínimo de 15 min é eficaz), até 60 min, antes de prosseguir com rotulagem metabólica com ácidos graxos. 2. Preparação e saponificação de análogos de ácidos graxos Prepare as soluções de estoque de ácidos graxos alquila com antecedência, solubilizando no DMSO para alcançar as seguintes concentrações e armazenar a -20 °C. Descongele à temperatura ambiente, conforme necessário. Armazene os preparativos para seu melhor desempenho sob N2 ou Ar.Alkynyl-myristate (ácido 13-tetradecynoico, 13-TDYA): 25 mMAlkynyl-palmitate (ácido 15-hexadecic; 15-HDYA): 100 mMAlkynyl-estearate (ácido acrídrico de 17 octadenoicos; 17-ODYA): 100 mM Para preparar 20% de BSA livre de ácido graxo (FAFBSA), pese 2 g de FAFBSA em um tubo descartável de 50 mL. Leve até 10 mL com DMEM pré-aquecido (37 °C). Misture por rotação final ou por vórtice, e coloque em um banho de água de 37 °C para dissolver completamente a FAFBSA. Use filtro de 0,2 μm para filtrar esterilizar o meio. Alíquota em volumes de aproximadamente 1 mL e armazenar a -20 °C. Descongele conforme necessário e aqueça até 37 °C em banho-maria antes de usar. Para aumentar a solubilidade dos análogos de ácido graxo e ácidos graxos, saponificar incubando com 20% de excesso molar de hidróxido de potássio (KOH) em frascos de reação cônica de vidro de 3 mL.NOTA: Estes frascos permitem que o sal permaneça solúvel, garantindo que a FAFBSA não congestione do calor elevado. O uso de vidro também impede que os ácidos graxos grudem no plástico. Pipeta fora pelo menos 2 μL de ácido graxo alquila analógico diretamente para o fundo de um frasco de reação cônica de 3 mL. Prepare 2 μL de lipídio por poço de uma placa de 6 poços usada (ver Tabela 1).NOTA: Devido à hidroofobidade dos ácidos graxos, é melhor revestir a ponta da pipeta, elaborando o volume desejado várias vezes antes de distribuí-lo no frasco de reação. Diluir 1 M KOH para concentrações equivalentes a 20% de excesso molar do rótulo de ácido graxo alquila (30 mM para 13-TDYA e 120 mM para 15-HDYA e 17-ODYA). Pipeta uma quantidade igual de KOH diluído (1 μL : 1 μL ácido graxo : KOH) perto da parte inferior do frasco de reação na borda do vidro, de tal forma que o volume dispensado do KOH se mistura com o ácido graxo. Feche a tampa do frasco e toque delicadamente para misturar as soluções.NOTA: A mistura pode se solidificar rapidamente, especialmente com o aumento dos comprimentos da cadeia de hidrocarbonetos do ácido graxo. Tenha cuidado para não encanar o sólido (ou seja, não misture por pipetação). Aqueça o frasco de reação a 65 °C por aproximadamente 5 minutos, ou assim que o ácido graxo for incorporado (a solução fica clara).NOTA: Os ácidos graxos com maior número de carbonos e a diminuição da solubilidade, como o estearato (17-ODYA), podem exigir tempos de incubação mais longos para serem totalmente incorporados ao KOH a 65 °C. Aumente a temperatura para 70 °C, se necessário. Um banho de água é melhor. Tome cuidado para que o líquido não evapore muito. Uma vez que os ácidos graxos tenham entrado em solução e nenhum sólido visível permaneça, pipeta pré-armada 20% FAFBSA de tal forma que a razão de volume de ácidos graxos: KOH: FAFBSA é 1: 1: 50 para alcançar uma concentração final de ácidos graxos alquilo ligados à BSA de 20x. Misture por pipetting para cima e para baixo. A solução normalmente parece clara sem sólidos visíveis.NOTA: Normalmente, quaisquer pequenos sólidos entrarão em solução após a incubação a 37 °C. Incubar o ácido graxo e FAFBSA por 15 min a 37 °C.NOTA: O rótulo saponificado neste momento é estável além de 15 min.   Volume total de mídia (mL) Vol. ácido graxo ou ácido graxo analógico (μL) Vol. KOH (μL) Vol. 20% FAFBSA (μL) Vol. total de rótulo saponificado conjugado pela BSA (μL) 4 4 4 200 208 2 2 2 100 104 Tabela 1: Razções de rotulagem de ácidos graxos saponificados. Volumes experimentais de ácido graxo, KOH e FAFBSA para a saponificação do rótulo de ácidos graxos de acordo com o volume de mídia utilizada. Como controle, repita o passo 2.3. com ácidos graxos sem rótulo de alkyne. Rotule as células com 1/20 volume do ácido graxo de 20x-BSA conjugado diretamente na mídia de fome (tipicamente, 100 μL em mídia/células de 2 mL) para alcançar uma concentração final de 1% BSA e 25 μM para alkynyl-myristate, ou 100 μM para alquilo-palmitato e alkynyl-estearato.NOTA: Para minimizar a quantidade de perturbação física às células anexadas, forme uma gota na ponta da pipeta perto da superfície da mídia em vez de tubos diretamente na mídia. Se usar inibidores de aciclização, adicione pelo menos 15 minutos antes dos ácidos graxos rotulados. Os tempos podem variar dependendo das células ou inibidores utilizados. Foi recomendado o uso da saponificação para esta etapa também28. Para comparação, adicione lipídios não saponificados por pipetação de 2 μL (ou equivalente ao volume saponizado) de ácido graxo sem rótulo diretamente na mídia de fome. Coloque as células de volta na incubadora e incubada por 3-6 h.NOTA: O tempo ideal de rotulagem pode precisar ser determinado para cada tipo de célula ou condição experimental. Tempos de incubação mais longos podem potencialmente levar à quebra dos ácidos graxos por β-oxidação e/ou incorporação em outros grupos lipídides, como fosfolipídios28. Lave suavemente as células com 1x PBS à temperatura ambiente. Colher e lise as células com 500 μL de ácido traocético (EDTA) sem ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (0,1% SDS, 50 mM N-2-hidroxiethylpiperazine-N-ácido etanoesulfônico (HEPES) pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% detergente não desnaturado, 0,5% de desoxicante de sódio, 2 mM MgCl2 com fluoreto de fenilmetilsulphonil de 1 mM recém-adicionado (PMSF) e 10 μg/μL Pepstatin A (ou coquetel inibidor completo de protease sem EDTA)) balançando os lisatos por 15 min a 4 °C. Centrifugar os lises a 16.000 x g por 10 min a 4 °C. Colete o supernatante em tubos de microcentrifuuagem de 1,7 mL e armazene a -20 °C até ficar pronto para prosseguir com a reação do clique.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os lysates estão estáveis a -20 °C por até 1 mês. No entanto, recomenda-se prosseguir com a reação do clique em tempo hábil. Quantifique as concentrações proteicas usando um ensaio adequado de acordo com o protocolo do fabricante, como um ensaio compatível com detergente (DC). 3. Clique na reação em lises celulares Prepare os reagentes para clicar em química. Dissolver amina tris-(benzyltriazolylme (TBTA) em DMSO a 2 mM. Armazene em alíquotas pequenas com dessecante a -20 °C por até 2-3 meses. Melhor armazenado em N2 ou Ar. Dissolver CuSO4 em água ddH2O para alcançar 50 mM. Guarde em temperatura ambiente por até 2 meses. Dissolver tris-carboxilimefosphine (TCEP) em água ddH2O a 250 mM. Armazene na escuridão a 4 °C e faça diluições frescas de 50 mM pouco antes da reação do clique. Prepare 2 mM azide em DMSO. Armazene em alíquotas pequenas com dessecante a -20 °C por até 6 meses. Melhor armazenado em N2 ou Ar.NOTA: Observou-se que os produtos com três ou mais grupos de polietileno glicols funcionaram melhor com biotina. Leve 50-100 μg de proteínas em tubos de microcentrifuus de 1,7 mL para o mesmo volume usando o mesmo tampão de lise acima.NOTA: Mantenha o volume de reação o menor possível (20-100 μL). Adicione sulfato de dodecyl de sódio (SDS) a cada amostra para atingir uma concentração final de 1%. Prepare uma mistura mestre de reagentes de clique para que as concentrações finais após a adição aos lysates sejam: 100 μM TBTA (estoque de 2 mM), 1 mM CuSO4, (estoque de 50 mM) 1 mM TCEP (estoque de 50 mM) e sonda azide de 100 μM (estoque de 2 mM). Combine soluções de estoque em conformidade (ver Tabela 2).NOTA: A ordem é importante. Misture completamente após a adição de cada componente. Adicione volumes apropriados da mistura mestre nos lises. Misture por pipetting para cima e para baixo. Incubar por 30 min no escuro em um banho de água de 37 °C. Agitar/misturar ocasionalmente. Reação total vol (μL) Vol. proteína (μL) Vol. TBTA (2 mM) (μL) Vol. CuSO4 (50 mM) (μL) Vol. TCEP (50 mM) (μL) Sonda vol. azido (2 mM) (μL) 50 43 2.5 1 1 2.5 100 86 5 2 2 5 Tabela 2: Clique nas razões de reagente e volume de proteínas. Volumes experimentais dos reagentes de química de cliques e concentrações de estoque correspondentes, além dos volumes de amostras de proteínas. 4. Clique na reação em proteínas imunoprecipitadas Alternativamente, é possível realizar a reação de clique em proteínas imunoprecipitadas (IP) dentro ou fora das contas.NOTA: Normalmente, realizar clique fora das contas leva ao menor plano de fundo e é melhor ao testar novas proteínas de interesse. Células transfectas para a proteína de interesse, neste caso, wildtype myristoylated C-terminal huntingtin (HTT) fundido a GFP (myr-ctHTT-GFP) e ctHTT-GFP com uma substituição G2A, usando coprecipitação de DNA fosfato de cálcio, como descrito anteriormente41. Placa 2,5 x 105 células/bem em placas de cultura tecidual de 6 poços e crescer durante a noite para ~70-80% de confluência. Prepare a mistura de DNA adicionando 2,5 μg de DNA em 10 μL com 99,75 μL de grau molecular H2O a um tubo de microcentrifutura de 1,7 mL. Em seguida, adicione 15,25 μL CaCl2 dropwise à mistura de DNA. Adicione a mistura DNA/CaCl2 a um tubo separado contendo 125 μL 2x HEPES tamponado (HBS, pH 7.0) de forma dropwise com a mistura. Adicione lentamente a mistura DNA/CaCl2/HBS às células. Depois de 2-4 h, substitua a mídia e incuba durante a noite. Prossiga com a rotulagem das etapas 1.3-2.8. Prepare volumes iguais de 500 μg de proteína no tampão de lise. Execute IP incubando com coelho anti-GFP para ctHTT-GFP girando durante a noite a 4 °C. Adicione contas de proteína G de 15-20 μL pré-equilibradas com tampão de lise em cada tubo e permita que ele reaja de ponta a 4 °C por 3h. Lave as contas com tampão de lise e resuspense em 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES tampão. Aqueça as contas a 80 °C por 15 min e inverta os tubos ou agitar aproximadamente a cada 5 minutos. Gire brevemente os tubos e retorne a 80 °C. Colete o supernante contendo as proteínas enquanto as amostras ainda estão quentes.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e as amostras imunoprecipitadas podem ser armazenadas a -20 °C ou -80 °C, se não forem usadas para clicar em química imediatamente. Permita que 43 μL do supernatante reajam com 7 μL de mistura mestre de reagentes de clique. Prossiga com a reação conforme indicado na etapa 3.2.3. 5. SDS-PAGE e mancha ocidental Pare a reação e a desnatura, adicionando 1x tampão de carga de amostra contendo dithiothreitol de 25 mM (DTT) e aqueça a 95 °C por 5 min.NOTA: Pode-se usar até 100 mM DTT28. Não use β-mercaptoetanol com proteínas S-acylated, pois pode hidrolisar as ligações do tioester e remover o analógico ácido graxo clicado. Rapidamente, gire as amostras. Separe as proteínas com SDS-PAGE em um gel de poliacrilamida, em duplicatas.NOTA: Dois géis são necessários para o tratamento alcalino com KOH para confirmar a presença de ligações de tioéster. Se usar uma sonda de azida fluorescente, a aciilação pode ser detectada em gel ou após a transferência usando o canal de excitação indicado. Transfira para membranas de fluoreto de polivinilidene (PVDF) (ativadas em metanol e enxaguadas em ddH2O – 5 min cada) com aparelho de transferência semi-seca a 25 V, 1,0 A (constante) por 30 min. Depois de enxaguar brevemente as membranas com ddH2O, mergulhe uma membrana de réplica em 0,1 M KOH em metanol/água (9:1 v/v) e a outra em 0,1 M Tris-HCl pH 7.0 em metanol/água (9:1 v/v) como um controle não alcalino por 60 min em temperatura ambiente com rocha suave. Enxágüe as membranas brevemente na água ddH2O, seguida por 6 vezes de 5 min de lavagem em PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20).NOTA: Lave bem. Bloqueie as membranas durante a noite em 5% de tampão de bloqueio de leite desnatado (1x PBS, 0,1% Tween20). 6. Executar mancha ocidental Onde indicado, sonda com streptavidina marcada fluorescente (1:5000) e controle de carregamento, rhodamina anti-GAPDH (1:5000) em 5% tampão de bloqueio BSA (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) à temperatura ambiente por 45-60 min com rocha suave, na escuridão. Teste a mancha de proteína imunoprecipitada primeiro com o anticorpo anti-GFP primário em 5% de tampão de bloqueio de leite desnatado, em seguida, com anticorpos secundários apropriados em 5% BSA como na etapa 6.1. Lave as membranas por 5 min em PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) um total de quatro repetições e enxágue com água ddH2O antes da imagem.

Representative Results

A diferença na eficiência de rotulagem entre os ácidos graxos alquilados (não-sapnificados) para a detecção da química de cliques pode ser visualizada e comparada pela intensidade do sinal de proteínas acicladas gordurosas através da mancha ocidental (Figura 1). Observou-se efeito perceptível com o aumento do comprimento das cadeias de aciis. Em células rotuladas com estearato de alquila (alk-stear), a saponificação do ácido graxo e a entrega com BSA para rotulagem metabólica aumentaram drasticamente a detecção de sinal de proteína S-acylated através da química do clique e detecção por uma sonda fluorescente azido (Figura 1, à direita), sugerindo um aumento geral na incorporação celular do rótulo de ácido graxo alkynyl. Por outro lado, não foi observada diferença perceptível nas células tratadas com o ácido graxo mais curto e solúvel, alkynyl-myristate (alk-myr; ácido 13-tetradecynoic ou 13-TDYA). As células rotuladas com alquilo-palmitato (Figura 1, meio) apresentaram um aumento intermediário no rótulo em comparação com alkynyl-myristate (13-TDYA), mas menos do que alquilo-estearato. É importante ressaltar que o tratamento das membranas PVDF com 0,1 M KOH removeu em grande parte os rótulos de ácidos graxos de células incubadas com alquilo-palmitato e alkynyl-estearate, confirmando que a maioria do sinal foi através de uma ligação éster ou thioester (Figura 1, painéis médio e direito, inferior). Como esperado, a incorporação de alquilo-myristate foi principalmente resistente a alcalinos (Figura 1, esquerda, painéis inferiores), devido à fixação de myristato às proteínas através de uma ligação amida. A Figura 2 demonstra a versatilidade e sensibilidade da química do clique para detectar aciilação gordurosa de proteínas imunoprecipitadas. As células HEK293T foram transfeinadas com a caça do terminal C myristoylated (HTT) fundida à GFP (myr-ctHTT-GFP) e rotulada com alquilo-myristate, como descrito anteriormente18. Após a imunoprecipitação, o CTHTT-GFP foi liberado das contas e submetido à química do clique ao lado dos lysates. Não só a miristoitação do tipo selvagem (TR) myr-ctHTT-GFP foi detectada nos imunoprecipitados, mas foi fortemente detectada nos lises, enquanto a mutação G2A bloqueou completamente a miristoylation do ctHTT-GFP (Figura 2). Figura 1: Detecção de proteínas aciclantes gordurosas usando química de clique. As células HEK293T foram incubadas diretamente com os ácidos graxos indicados (não-seiva) ou após a saponificação (seiva) e incubação com a proteína portadora BSA, conforme descrito no protocolo 2.1-2.7. Os ácidos graxos alquilíricos foram ligados ao azida fluorescente submetendo 100 μg de lisatos proteicos à química de cliques, separados por SDS-PAGE, e transferidos para membranas PVDF. Após o tratamento com 0,1 M Tris pH 7.0 ou 0,1 M KOH, para reverter as ligações de tioester, a aciilação gordurosa foi detectada usando um azida fluorescente. GAPDH foi usado como controle de carregamento; rhodamina anti-GAPDH (1:5.000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Detecção de N-myristoylated ctHTT-GFP usando química de clique. As células HEK293T foram transfeinadas com C-terminally truncado (ct) e forma myristoylatable de HTT (myr-ctHTT-GFP) e rotuladas com alquilo-myristate. Uma forma não mistilável com a glicina essencial substituída por uma alanina foi incluída (G2A). Após a colheita e lise, o CTHTT-GFP foi imunoprecipitado utilizando anti-GFP de cabra. Os lysates foram submetidos à reação química do clique (esquerda), bem como imunoprecipitados após a liberação das contas. A miristoitação foi detectada usando Streptavidin Alexa 680 (SA680). O GFP foi detectado usando o anti-GFP de coelho em combinação com o anti-coelho Alexa 488. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Esquema de fluxo de trabalho do protocolo experimental. Esboço do fluxo de trabalho das principais etapas experimentais do protocolo. Vários pontos são observados onde o protocolo pode ser pausado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A adição direta de ácidos graxos às células na cultura pode resultar em insolubilidade, precipitação de lipídios e lipotoxicidade40. Consequentemente, a adição de ácidos graxos diretamente às células pode não apenas resultar em má absorção celular e baixa disponibilidade do rótulo de ácidos graxos, mas também um número reduzido de células viáveis para análise a jusante, bem como ativação de caminhos fora do alvo. No entanto, muitos protocolos de rotulagem metabólica para detecção de química de cliques envolvem a adição direta de ácidos graxos e um grande número de estudos palmitoyl-proteome usando a detecção de química de cliques até hoje raramente saponificar os rótulos de ácidos graxos ou incuba-los com BSA8,36. É importante considerar o fato de que a eficiência e sensibilidade da detecção de química de cliques de proteínas aciclantes dependem da absorção celular suficiente dos análogos de ácidos graxos. Portanto, é razoável especular que muitas proteínas S-acylated podem ter escapado da detecção em estudos proteômicos devido à baixa disponibilidade dos rótulos de ácidos graxos a partir da má incorporação nas células, especialmente quando o ácido graxo de cadeia mais longa 17-ODYA foi usado. 17-ODYA, ou alkynyl-stearate, tem sido o rótulo de escolha amplamente utilizado para vários estudos devido à sua disponibilidade comercial e seu uso precoce8,36. No entanto, os resultados deste protocolo demonstram que a saponificação do 17-ODYA resulta no maior aumento na detecção de proteínas S-acylated, em comparação com ácidos graxos de cadeia mais curta, como palmitato ou mirânita. Portanto, repetir esses experimentos com rótulos saponificados pode produzir substratos adicionais de Acieração S que podem ter sido previamente negligenciados. Além disso, enquanto a maioria dos acyltransferases palmitoyl preferem palmitato para S-acylation, alguns têm preferências por outros comprimentos de ácidos graxos, como estearato15,38,44. Além disso, algumas proteínas ou mesmo locais específicos dentro das proteínas preferem um ácido graxo em vez de outros 15,45. Portanto, estudos que usam 17-ODYA podem ter um viés em relação às proteínas S-acylated com estearato, não palmitato, ao mesmo tempo em que sub-representam essas proteínas devido à menor detecção.

A melhor eficiência de rotulagem metabólica para a química do clique depende da saponificação dos lipídios e da incubação com etapas fafbsa, bem como do FBS delipidado. Todos os ácidos graxos devem ser completamente saponizados em KOH sem sólidos visíveis restantes antes de prosseguir com a incubação com a FAFBSA. Este pode ser um passo difícil e o tempo é crucial. Depois que os ácidos graxos saponificados entrarem em solução a 65 °C, adicione bsa quente imediatamente, pois um aquecimento adicional causará evaporação do DMSO dos ácidos graxos. Além disso, o rótulo saponizado começará a se solidificar assim que começar a esfriar. Portanto, a FAFBSA deve ser quente e adicionada rapidamente após o sal se tornar solúvel. Os frascos de reação de vidro, e sua forma são importantes para esta etapa. Eles permitem que o lipídio saponizado seja quente o suficiente para permanecer solúvel, enquanto frio o suficiente para garantir que a FAFBSA não congestione. A mistura suficiente via pipetação também é importante nesta etapa para garantir uma solução homogênea para rotulagem.

Os reagentes para química de clique precisam ser armazenados adequadamente, normalmente com dessecantes ou sob gás N2 ou Ar a -20 °C a -80 °C. A falta de sinal de aciclização ou sinal fraco pode ser devido a reagentes instáveis, particularmente soluções mais antigas de TBTA e azide stock. Além disso, deve-se tomar cuidado com soluções fluorescentes de azida, que precisam ser protegidas da luz o máximo possível. Além disso, variáveis como método de privação lipídica e tempo de rotulagem podem precisar ser testadas para determinar as condições ideais dependendo do tipo de célula utilizada. Por exemplo, as células neuronais podem precisar de tempos de rotulagem mais longos porque as alterações na mídia e a privação lipídica são difíceis (inéditas).

O benefício deste protocolo é mais dramático quando usado para ácidos graxos de cadeia mais longa. Para cadeias mais curtas, o aumento da intensidade do sinal torna-se menos dramático, mas ainda é provável que proteção para as células. Embora as modificações sugeridas melhorem a detecção de aciilação de proteínas em geral, a química do clique ainda é considerada um método centrado em lipídios1 que se limita à detecção de proteínas dinâmicas, não stably S-acylated1. Outras limitações a considerar incluem a exigência de privação de ácidos graxos para promover a rotulagem, e sua gama relativamente limitada de tipos de células compatíveis quando comparada com a detecção de troca de aciila-biotina (ABE) de S-acylation16. Apesar dessas limitações, a detecção de química de cliques é mais rápida do que a maioria dos ensaios de troca de aciis e é mais adequada para a detecção de proteínas que não toleram os repetidos passos de precipitação proteica necessários para ensaios de troca de aciis. Além disso, essa abordagem pode ser combinada com rotulagem simultânea usando outros ensaios de clique, como análise de perseguição de pulso38.

O uso desta modificação para rotulagem metabólica para química de cliques aumentou a detecção geral de proteínas acicladas, particularmente S-acylated, com uma variedade de técnicas proteômicas que são usadas em conjunto com a química do clique. Como mostrado, a detecção fluorogênica pode ser usada como alternativa à biotina (Figura 1)28. Isso é particularmente útil porque não há proteínas endógenas fluorescentes nos lises celulares. Além disso, fluoroforos que só são ativados após o clique em química podem ser usados46. O ácido graxo saponizado e vinculado à FAFBSA para rotulagem química de cliques pode ajudar com dificuldades para detectar proteínas de interesse devido a um aumento geral na quantidade de rótulo disponível na célula e limitando efeitos tóxicos da adição de ácidos graxos diretamente à mídia. Também pode ser utilizado em conjunto com a espectrometria de massa27 para aumentar a detecção de proteínas de baixa abundância, especialmente quando tomadas em conjunto com o recente avanço usando algoritmos de aprendizagem de máquina impedindo medidas redundantes para aumentar a sensibilidade a proteínas de baixa abundância, em oposição à aquisição dependente de dados existente que favorece a detecção das proteínas mais abundantes47 . Além disso, a química do clique pode ser combinada com rotulagem estável de isótopos com aminoácidos na cultura celular (SILAC) e métodos de perseguição de pulso para produzir dados quantificáveis sobre proteína dinâmica S-acylation27. Finalmente, o grupo Hannoush combinou química de clique com ensaio de ligadura de proximidade (PLA) para permitir visualização de células únicas e exames na distribuição subcelular de proteínas palmitoylated43,48.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Pesquisa em Ciência e Engenharia (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao foi financiada pela Bolsa Memorial Ram e Lekha Tumkur através do Departamento de Biologia da Universidade de Waterloo, e do Lucy Morrison Memorial Bursary através do IODE Ontário, além do financiamento de pesquisa de pós-graduação da Universidade de Waterloo que compreende o Studentship de Pesquisa de Pós-Graduação (50503-11072), Prêmio de Pós-Graduação em Ciências e Assistente de Ensino de Pós-Graduação. Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório Martin pelo apoio na preparação deste manuscrito, particularmente Stephanie Ryall, Harleen Gill e Sadia Khan, que ajudaram inicialmente a criar o Laboratório Martin em preparação para esses estudos. Os autores também gostariam de agradecer ao Dr. Luc Berthiaume pelo tipo de presente das construções ctHTT-GFP e do Dr. Shaun Sanders por contribuições críticas na preparação do manuscrito. A Figura 3 foi criada com BioRender.com.

Materials

13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) Click Chemistry Tools 1164
15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) Click Chemistry Tools 1165
17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) Cayman Chemical Company 90270
30% acrylamide/bis solution 29:1 Biorad 1610156
96-well plate reader Biorad N/A
AFDye 647 azide plus Click Chemistry Tools 1482
Ammonium persulfate (APS) Biorad 1610700
Anti-GAPDH hFAB Rhodamine Biorad 12004167
Anti-rabbit Alexa 488 Invitrogen A11034
Anti-Tubulin hFAB Rhodamine Biorad 12004166
Biotin Azide Click Chemistry Tools 1265
Bis-tris, ultrapure VWR 715
Calcium chloride J.T. Baker 1332-1
Centrifuge 16,000xg, 4°C Thermo Scientific N/A
Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) Life Technologies A3382101
ChemiDoc Imager Biorad N/A
Copper sulfate (1 mM) VWR BDH9312
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate MP Biomedicals 102906
Detergent compatible (DC) assay Biorad N/A
Dimethyl sulfoxide (DMSO) VWR 0231-500 mL
DMEM, 1x Wisent Inc 319015CL
Ethanol, anhydrous N/A N/A
Fatty Acid Free BSA MP Biomedicals 219989950
Fast Blot Turbo Semi-dry transfer Biorad N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12483-020
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid VWR 5011
Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 VWR N/A
Igepal CA-630 Alfa Aesar J61055
Image Lab Software Biorad N/A
L-glutamine supplement solution Wisent Inc 609-065-EL
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214-500
Methanol VWR BDH1135
Myristic Acid (25 mM) VWR M0476-25G
Palmitic acid (100 mM) VWR P0002-25G
Penicillin-Streptomycin, 10x Wisent Inc 450201EL
Pepstatin A (synthetic) Enzo Life Sciences ALX-260-085-M005
Phenylmethylsulfonyl fluoride Enzo Life Sciences ALX-270-184-G005
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 VWR 75801-000
Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) Eusera EU4
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
Potassium hydroxide Ward's Science 470302-100
Rabbit polyclonal antibody to GFP Eusera EU1
Sodium chloride VWR 0241-1KG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Sodium pyruvate Wisent Inc 600-110-EL
Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate Thermo Fisher Scientific S21378
Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) Click Chemistry Tools 1061
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) Soltec Ventures M115
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypsin/EDTA Wisent Inc 325-043-CL
Tween 20 Reagent Grade 1L VWR 97062-332
WHEATON NextGen V Vials 3 mL VWR 89085-424
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Referenzen

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Liao, L. M. Q., Gray, R. A. V., Martin, D. D. O. Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry. J. Vis. Exp. (170), e62107, doi:10.3791/62107 (2021).
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