JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemie

Geoptimaliseerde integratie van alkynylvetzuuranalogen voor de detectie van vetacyleiwitten met behulp van Click Chemistry

Published: April 09, 2021
doi:
10.3791/62107
, ,
1Department of Biology,University of Waterloo

Summary

De studie van vetacylatatie heeft belangrijke implicaties in cellulaire eiwitinteracties en ziekten. Hier wordt een aangepast protocol gepresenteerd om de detectie van vet-geacyleerde eiwitten te verbeteren, die kunnen worden toegepast in verschillende celtypen en gecombineerd met andere testen, waaronder pulsachtervolging en massaspectrometrie.

Abstract

Vetaylering, de covalente toevoeging van verzadigde vetzuren aan eiwitsubstraten, is belangrijk bij het reguleren van een groot aantal cellulaire functies, naast de implicaties ervan bij kanker en neurodegeneratieve ziekten. Recente ontwikkelingen in vetacylatiedetectiemethoden hebben een efficiënte en niet-gevaarlijke detectie van vet-acyleerde eiwitten mogelijk gemaakt, met name door het gebruik van klikchemie met bio-orthogonale etikettering. De detectie van klikchemie kan echter worden beperkt door de slechte oplosbaarheid en mogelijke toxische effecten van het toevoegen van lange keten vetzuren aan celkweek. Hier wordt een etiketteringsbenadering beschreven met geoptimaliseerde toediening met behulp van verzeepte vetzuren in combinatie met vetzuurvrij BSA, evenals gedelipide media, die de detectie van moeilijk te detecteren vet-acyleerde eiwitten kunnen verbeteren. Dit effect was het meest uitgesproken met het alkynyl-stearaatanaloog, 17-ODYA, dat het meest gebruikte vetzuuranaloog is geweest bij de detectie van geacyleerde eiwitten. Deze modificatie zal de cellulaire opname verbeteren en de gevoeligheid voor acylated protein detection verhogen. Bovendien kan deze benadering worden toegepast in verschillende celtypen en worden gecombineerd met andere assays zoals puls-chase-analyse, stabiele isotoopetikettering met aminozuren in celkweek en massaspectrometrie voor kwantitatieve profilering van vet-geacyleerde eiwitten.

Introduction

Vetaylering omvat de covalente toevoeging van vetzuren aan eiwitten en staat bekend om zijn belang bij het bevorderen van eiwit-membraaninteracties, maar er is ook aangetoond dat het eiwit-eiwitinteracties, conformatieveranderingen en katalytische plaatsen van enzymen bevordert1,2,3,4,5,6,7 . Vetaylering is naar voren gekomen als een potentieel medicijndoelwit in een groot aantal ziekten, waaronder infectie, kanker, ontsteking en neurodegeneratie, waar verstoringen in palmitoylatie zijn gedocumenteerd8,9,10,11,12,13. Dit is voornamelijk gestimuleerd door de ontwikkeling van nieuwe chemische detectiemethoden, die grootschalige identificatie van S-acylated protein targets mogelijk maakten.

Vetaylering kan een verscheidenheid aan modificaties omvatten waarbij de covalente toevoeging van verzadigde en onverzadigde vetzuren betrokken is, maar verwijst meestal naar N-myristoylation en S-acylatatie. N-myristoylation verwijst naar de toevoeging van myristinezuur aan N-terminale glycines, hetzij co-translationeel op ontluikende polypeptiden of posttranslationeel op nieuw blootgestelde N-terminale glycines na proteolytische splitsing2,14. N-myristoyatie vindt plaats door een onomkeerbare amidebinding. Aan de andere kant verwijst S-acylering meestal naar de omkeerbare toevoeging van lange keten vetzuren aan cysteïneresiduen via een thioesterbinding. De meest voorkomende vorm van deze wijziging omvat de opname van palmitaat en wordt daarom gewoonlijk aangeduid als S-palmitoylatie, of gewoon palmitoylatie11,15. In veel opzichten is S-palmitoylatie vergelijkbaar met fosforylering. Het is dynamisch, enzymatisch gereguleerd en blijkt zeer handelbaar te zijn.

Tot het laatste decennium werd het bestuderen van vetacylering belemmerd door beperkte detectiemethoden, waarvoor radioactief gelabelde vetzuren nodig waren. Dit had verschillende nadelen, waaronder kosten, veiligheidsproblemen en zeer lange detectietijden. Typisch werd tritiated of gejodeerd palmitaat gebruikt voor de detectie van S-acylering16. Tritiated palmitate vereiste lange detectieperioden met autoradiografiefilm, die weken tot maanden kunnen duren. Hoewel [125I] jood-vetzuuranalogen de detectietijden verkortten, vormde het een veel hoger veiligheidsrisico en vereiste het nauwlettende schildkliermonitoring van experimentatoren. Bovendien waren deze methoden niet-kwantitatief, waardoor de mogelijkheid om dynamische palmitoylatie te meten werd beperkt, en ook tijdrovend om op te zetten en op te ruimen vanwege de extra persoonlijke beschermingsmiddelen en radioactieve monitoring. Ten slotte waren radioactieve labels niet goed geschikt voor proteomische studies en meestal beperkt tot detectie van specifieke eiwitten met lage doorvoer. Naarmate er meer substraten werden gedetecteerd en onvermijdelijk de enzymen die elke modificatie bemiddelen werden geïdentificeerd, was het duidelijk dat nieuwe detectiemethoden nodig waren17,18,19,20,21. Vrijwel gelijktijdig ontstonden verschillende nieuwe methoden voor de detectie van vetgeacyleerde eiwitten. De eerste maakt gebruik van de reversibiliteit en reactiviteit van de thioesterbinding van S-acylering. De acyl-biotine uitwisseling (ABE) test vervangt chemisch palmitaat door biotine voor daaropvolgende pulldown van S-acylated eiwitten met behulp van avidine agarose kralen en directe detectie door western blot22,23,24. Vervolgens werden bio-orthogonale etikettering van vetzuren en chemoselectieve toevoeging aan tags of handvatten ontwikkeld die het gebruik van de Staudinger-ligatie en klikchemie omvatten25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Ten slotte vervangt acylhars assisted capture (RAC) net als de ABE in wezen S-acylated sites door thiol-reactieve kralen voor het vangen en detecteren van S-acylated proteins34,35. Samen hebben de op uitwisseling en klikchemie gebaseerde assays efficiëntere en gevoeligere methoden voor acyleringsdetectie en affiniteitszuivering voor downstream-analyse opgeleverd en hebben vervolgens geleid tot de ontdekking van duizenden S-geacyleerde eiwitten8,36.

De term klikchemie omvat een groep chemische reacties, maar verwijst meestal naar het Cu(I)-gekatalyseerde azido-alkyne [3+2] cycloadditiereactiemechanisme tussen een alkynylgroep en een azidogroep27,28,37. In het bijzonder, in het geval van vetaylering, omvat klikchemie de detectie van S-palmitoylering of N-myristylering door bio-orthogonale 16-koolstofalkynyl-palmitaat (15-hexadecyninezuur; 15-HDYA) of de 14-koolstofalkynyl-myristaat (13-tetradecynogeenzuur; 13-TDYA) respectievelijk in cellen op te nemen om endogene geacyleerde eiwitten te labelen28 . Na cellysis en immunoprecipitatie van het eiwit van belang, wordt een klikchemiereactie (covalente koppeling tussen een alkyn en een azide) uitgevoerd om een affiniteitsonde, typisch biotine, te binden voor detectie door western blot28,37. Als alternatief kan klikchemie worden uitgevoerd op het totale cellysaat en kunnen vet geacyleerde eiwitten worden gezuiverd voor identificatie door massaspectrometrie. De initiële klikchemiereactie met azido-biotine verhoogde de selectiviteit en gevoeligheid van detectie meer dan een miljoen keer in vergelijking met radioactiviteit2. Een ander voordeel van klikchemie is dat het kan worden gecombineerd met andere klassieke etiketteringsmethoden, zoals puls-achtervolgingsanalyse van eiwitomzet met behulp van azido-homoalanine voor kwantitatieve analyse38. Bovendien kunnen fluorescerende sondes worden gebruikt in plaats van biotine of andere biochemische sondes, zoals FLAG- of Myc-tags, om eiwitlokalisatie te onderzoeken16,28,39.

Ondanks het relatieve gebruiksgemak van klikchemie, kan de detectie worden beperkt door de lage oplosbaarheid en potentiële toxiciteit van het gebruik van lange keten vrije vetzuren in celkweek40. In het bijzonder, ondanks de voorkeur van palmitaat tijdens S-acylering voor de meerderheid van de eiwitten, hebben veel studies het 18-koolstofstearaat (17-octadecyaanzuur – 17-ODYA) gebruikt in plaats van palmitaat (15-HDYA) voor het detecteren van S-acylated eiwitten vanwege de commerciële beschikbaarheid en relatief lage kosten. 17-ODYA is echter zeer onoplosbaar en vereist speciale aandacht bij gebruik. Bovendien kan klikchemie enige genuanceerde voorbereiding en opslag van chemicaliën vereisen. Hierin beschrijft het protocol een etiketteringsbenadering, die de levering optimaliseert met behulp van verzeping van vetzuren, levering met vetzuurvrij BSA en gedelipideerd foetaal runderserum (FBS) om de oplosbaarheid te verhogen en potentiële toxische effecten van het toevoegen van vrije vetzuren aan cellen te omzeilen28. Deze methode werkt in verschillende celtypen en is zelfs gebruikt bij levende dieren28.

Protocol

1. Celkweek Om DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) voor celkweek aan te vullen, voegt u 10% Foetaal Runderserum (FBS), 1x Penicilline-Streptomycine, 2 mM L-glutamine en 100 mM natriumpyruvaat (1% vol /vol) toe. Plaats ongeveer 5 x 105 HEK293T cellen/put van een 6-well tissuekweekschaal en groei gedurende 18 uur in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2 om 75%-80% confluentie te bereiken. Vetzuur serum deprivatie Als u etiketteringsmedia wilt voorbereiden, bereidt u DMEM zoals hierboven (stap 1.1) voor zonder 10% FBS. Vervang FBS door 5% dextran-charcoal coated FBS (DCC-FBS). Voorverwarmen tot 37 °C voor gebruik. Was de cellen voorzichtig met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur en vervang door etiketteermedia.OPMERKING: HEK293T-cellen maken gemakkelijk los van weefselkweekplaten. Wees voorzichtig bij het wassen van cellen en het vervangen van media. Minimaliseer agitatie tijdens de overdracht van en naar de couveuse zoveel mogelijk. Breng de cellen terug naar de incubator van 37 °C met 5% CO2 en incubeer ongeveer 45 minuten (minimaal 15 minuten is effectief), tot 60 minuten, voordat u overgaat tot metabole etikettering met vetzuren. 2. Bereiding en verzeping van vetzuuranalogen Bereid de stamoplossingen van alkynylvetzuren van tevoren voor door oplosbaarheid in DMSO om de volgende concentraties te bereiken en bewaar bij -20 °C. Ontdooi indien nodig op kamertemperatuur. Bewaar de voorbereidingen voor hun beste prestaties onder N2 of Ar.Alkynyl-myristaat (13-tetradecyaanzuur, 13-TDYA): 25 mMAlkynylpalmitaat (15-hexadecyaanzuur; 15-HDYA): 100 mMAlkynylstearaat (17-octadecyaanzuur; 17-ODYA): 100 mM Om 20% vetzuurvrij BSA (FAFBSA) te bereiden, weeg je 2 g FAFBSA in een wegwerpbuis van 50 ml. Breng tot 10 ml met voorverwarmde (37 °C) DMEM. Meng door end-over-end rotatie of door vortexing en plaats in een waterbad van 37 °C om FAFBSA volledig op te lossen. Gebruik een filter van 0,2 μm om het medium te filteren. Aliquot in volumes van ongeveer 1 ml en bewaren bij -20 °C. Ontdooi indien nodig en verwarm tot 37 °C in een waterbad voor gebruik. Om de oplosbaarheid van de vetzuur- en vetzuuranalogen te verbeteren, verzeping door te incuberen met 20% molaire overmaat kaliumhydroxide (KOH) in glazen conische reactieflacons van 3 ml.OPMERKING: Deze injectieflacons zorgen ervoor dat het zout oplosbaar blijft en zorgen ervoor dat de FAFBSA niet stolt van het hoge vuur. Het gebruik van glas voorkomt ook dat vetzuren aan het plastic blijven plakken. Pipetteer ten minste 2 μL alkynylvetzuur analoog rechtstreeks naar de bodem van een conische reactieflacon van 3 ml. Bereid 2 μL lipide per putje van een gebruikte 6-putplaat (zie tabel 1).OPMERKING: Vanwege de hydrofobiciteit van vetzuren is het het beste om de punt van de pipet te coaten door het gewenste volume meerdere keren op te stellen voordat u het in de reactieflacon doseert. Verdun 1 M KOH tot concentraties gelijk aan 20% molaire overmaat van het alkynylvetzuuretiket (30 mM voor 13-TDYA en 120 mM voor 15-HDYA en 17-ODYA). Pipetteer een gelijke hoeveelheid verdund KOH (1 μL: 1 μL vetzuur: KOH) dicht bij de bodem van de reactieflacon aan de rand van het glas, zodat het afgegeven volume van de KOH zich mengt met het vetzuur. Sluit het deksel van de injectieflacon en tik voorzichtig om de oplossingen te mengen.OPMERKING: Het mengsel kan snel stollen, vooral bij toenemende lengtes van de koolwaterstofketen van het vetzuur. Zorg ervoor dat u de vaste stof niet pipettert (d.w.z. niet mengen door te pipetteren). Verwarm de reactieflacon bij 65 °C gedurende ongeveer 5 minuten of zodra het vetzuur is opgenomen (oplossing wordt helder).OPMERKING: Vetzuren met een hoger aantal koolstofatomen en verminderde oplosbaarheid, zoals stearaat (17-ODYA), kunnen langere incubatietijden nodig hebben om volledig in de KOH te worden opgenomen bij 65 °C. Verhoog indien nodig de temperatuur tot 70 °C. Een waterbad is het beste. Let er wel op dat de vloeistof niet te veel verdampt. Zodra de vetzuren in oplossing zijn gegaan en er geen zichtbare vaste stoffen overblijven, pipetteer voorgewarmd 20% FAFBSA zodanig dat de volumeverhouding van vetzuren: KOH: FAFBSA 1: 1: 50 is om een uiteindelijke concentratie van 20x BSA-gebonden alkynylvetzuren te bereiken. Meng door op en neer te pipetteren. De oplossing ziet er meestal helder uit zonder zichtbare vaste stoffen.OPMERKING: Meestal gaan kleine vaste stoffen na incubatie bij 37 °C in oplossing. Incubeer het vetzuur en FAFBSA gedurende 15 min bij 37 °C.OPMERKING: Het verzeepte etiket op dit punt is stabiel na 15 minuten.   Totaal mediavolume (ml) Vol. vetzuur of vetzuur analoog (μL) Vol. KOH (μL) Vol. 20% FAFBSA (μL) Totaal vol. van BSA-geconjugeerd verzeept etiket (μL) 4 4 4 200 208 2 2 2 100 104 Tabel 1: Verzeepte vetzuuretiketteringsverhoudingen. Experimentele volumes van vetzuur, KOH en FAFBSA voor de verzeping van vetzuurlabel volgens het volume van de gebruikte media. Herhaal als besturingselement stap 2.3. met vetzuren zonder alkynlabel. Label de cellen met 1/20 volume van het 20x vetzuur-BSA-conjugat rechtstreeks op de uithongeringsmedia (meestal 100 μL in 2 ml media / cellen) om een uiteindelijke concentratie van 1% BSA en 25 μM voor alkynyl-myristaat, of 100 μM voor alkynylpalmitaat en alkynyl-stearaat te bereiken.OPMERKING: Om de hoeveelheid fysieke verstoring van de aangesloten cellen te minimaliseren, vormt u een druppel aan de punt van de pipet dicht bij het oppervlak van het medium in plaats van rechtstreeks in de media te pipetteren. Als u acyleringsremmers gebruikt, voeg dan ten minste 15 minuten voorafgaand aan de gelabelde vetzuren toe. Tijden kunnen variëren, afhankelijk van de gebruikte cellen of remmer. Het is aanbevolen om de verzeping ook voor deze stap te gebruiken28. Voeg ter vergelijking niet-verzeepte lipiden toe door 2 μL (of equivalent aan volume verzeept) ongelabeld vetzuur rechtstreeks in de uithongeringsmedia te pipetteren. Plaats cellen terug in de couveuse en incubeer gedurende 3-6 uur.OPMERKING: De optimale timing van de etikettering moet mogelijk worden bepaald voor elk celtype of experimentele toestand. Langere incubatietijden kunnen mogelijk leiden tot de afbraak van de vetzuren door β-oxidatie en/of opname in andere lipidengroepen, zoals fosfolipiden28. Was de cellen voorzichtig met 1x PBS op kamertemperatuur. Oogst en lyseer de cellen met 500 μL ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-vrije gemodificeerde radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer (0,1% SDS, 50 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanensulfonzuur (HEPES) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% niet-denaturerend wasmiddel, 0,5% natriumdeoxycholaat, 2 mM MgCl2 met vers toegevoegde 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en 10 μg/μL Pepstatine A (of EDTA-vrije volledige proteaseremmercocktail)) door de lysaten gedurende 15 minuten bij 4 °C te laten schommelen. Centrifugeer de lysaten bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel het supernatant in microcentrifugebuizen van 1,7 ml en bewaar het bij -20 °C totdat het klaar is om door te gaan met de klikreactie.OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Lysaten zijn stabiel bij -20 °C gedurende maximaal 1 maand. Het wordt echter aanbevolen om tijdig door te gaan met de klikreactie. Kwantificeer de eiwitconcentraties met behulp van een geschikte test volgens het protocol van de fabrikant, zoals een detergentcompatibele (DC) test. 3. Klikreactie op cellysaten Bereid de reagentia voor op klikchemie. Los tris-(benzyltriazolylmethyl) amine (TBTA) op in DMSO tot 2 mM. Bewaren in kleine aliquots met droogmiddel bij -20 °C gedurende maximaal 2-3 maanden. Best opgeslagen onder N2 of Ar. Los CuSO4 op in ddH2O water om 50 mM te bereiken. Bewaren bij kamertemperatuur gedurende maximaal 2 maanden. Los tris-carboxyethylfosfine (TCEP) op in ddH2O water tot 250 mM. Bewaren in het donker bij 4 °C en verse verdunningen van 50 mM vlak voor de klikreactie. Bereid 2 mM azide in DMSO. Bewaren in kleine hoeveelheden met droogmiddel bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Best opgeslagen onder N2 of Ar.OPMERKING: Er werd waargenomen dat de producten met drie of meer polyethyleenglycolgroepen het beste werkten met biotine. Breng 50-100 μg eiwitlysaten in microcentrifugebuizen van 1,7 ml tot hetzelfde volume met dezelfde lysisbuffer als hierboven.OPMERKING: Houd het reactievolume zo klein mogelijk (20-100 μL). Voeg natriumdodecylodylsulfaat (SDS) toe aan elk monster om een uiteindelijke concentratie van 1% te bereiken. Bereid een mastermix van klikreagentia voor zodat de uiteindelijke concentraties na toevoeging aan de lysaten zijn: 100 μM TBTA (2 mM voorraad), 1 mM CuSO4, (50 mM voorraad) 1 mM TCEP (50 mM voorraad) en 100 μM azide sonde (2 mM voorraad). Combineer dienovereenkomstig voorraadoplossingen (zie tabel 2).OPMERKING: De volgorde is belangrijk. Meng volledig na toevoeging van elk onderdeel. Voeg de juiste volumes van de mastermix toe aan de lysaten. Meng door op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 30 minuten in het donker in een waterbad van 37 °C. Roer/meng af en toe. Totaal reactievolume (μL) Vol. eiwit (μL) Vol. TBTA (2 mM) (μL) Vol. CuSO4 (50 mM) (μL) Vol. TCEP (50 mM) (μL) Vol. azido sonde (2 mM) (μL) 50 43 2.5 1 1 2.5 100 86 5 2 2 5 Tabel 2: Klik op reagens- en eiwitvolumeverhoudingen. Experimentele volumes van de click chemistry reagentia en bijbehorende voorraadconcentraties, naast de volumes eiwitmonsters. 4. Klikreactie op immunoprecipiteerde eiwitten Als alternatief is het mogelijk om de klikreactie uit te voeren op immunoprecipiteerde (IP) eiwitten op of naast de kralen.OPMERKING: Meestal leidt het uitvoeren van de klik op de kralen tot de minste achtergrond en is het het beste bij het testen van nieuwe eiwitten van belang. Transfectcellen voor het eiwit van belang, in dit geval wildtype myristoylated C-terminal huntingtine (HTT) gefuseerd met GFP (myr-ctHTT-GFP) en ctHTT-GFP met een G2A-substitutie, met behulp van calciumfosfaat DNA-coprecipitatie, zoals eerder beschreven41. Plaat 2,5 x 105 cellen /put in 6-well weefselkweekplaten en groei ‘s nachts tot ~ 70-80% confluentie. Bereid het DNA-mengsel voor door 2,5 μg DNA in 10 μL met 99,75 μL moleculaire kwaliteit H2O toe te voegen aan een microcentrifugebuis van 1,7 ml. Voeg vervolgens 15,25 μL CaCl2 druppelsgewijs toe aan het DNA-mengsel. Voeg DNA/CaCl2-mengsel toe aan een aparte buis met 125 μL 2x HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS, pH 7,0) op een druppelsgewijze manier met mengen. Voeg langzaam de DNA/CaCl2/HBS mix toe aan cellen. Vervang na 2-4 uur de media en incubeer ‘s nachts. Ga verder met labelen uit stap 1.3-2.8. Bereid gelijke volumes van 500 μg eiwit in lysisbuffer. Voer IP uit door te broeden met konijn anti-GFP voor ctHTT-GFP die ‘s nachts bij 4 °C draait. Voeg 15-20 μL eiwit G-kralen vooraf gebalanceerd met lysisbuffer toe aan elke buis en laat deze gedurende 3 uur end-over-end reageren bij 4 °C. Was de kralen met lysisbuffer en resuspend in 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES buffer. Verwarm de kralen gedurende 15 minuten op 80 °C en keer de buizen om of roer ongeveer elke 5 minuten. Draai de buizen kort rond en keer terug naar 80 °C. Verzamel het supernatant dat de eiwitten bevat terwijl de monsters nog warm zijn.OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de immunoprecipiteerde monsters kunnen worden bewaard bij -20 °C of -80 °C, indien niet meteen gebruikt voor klikchemie. Laat 43 μL van het supernatant reageren met een mastermix van klikreagentia van 7 μL. Ga verder met de reactie zoals vermeld in stap 3.2.3. 5. SDS-PAGE en western blotting Stop de reactie en denaturatie door 1x monsterbelastingsbuffer met 25 mM dithiothreitol (DTT) toe te voegen en gedurende 5 minuten bij 95 °C te verwarmen.OPMERKING: Tot 100 mM DTT kan worden gebruikt28. Gebruik geen β-mercaptoethanol met S-geacyleerde eiwitten, omdat dit de thioesterbindingen kan hydrolyseren en het aangeklikte vetzuuranaloog kan verwijderen. Draai de monsters kort naar beneden. Scheid de eiwitten met SDS-PAGE op een polyacrylamidegel, in duplicaten.OPMERKING: Twee gels zijn nodig voor de alkalische behandeling met KOH om de aanwezigheid van thioesterbindingen te bevestigen. Bij gebruik van een fluorescerende azidesonde kan acylering in de gel of na overdracht worden gedetecteerd met behulp van het aangegeven excitatiekanaal. Breng over op polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen (geactiveerd in methanol en gespoeld in ddH2O – elk 5 min) met semi-droge transferapparatuur op 25 V, 1,0 A (constant) gedurende 30 min. Na het kort spoelen van de membranen met ddH2O, weekt u één replicaatmembraan in 0,1 M KOH in methanol/water (9:1 v/v) en het andere in 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 in methanol/water (9:1 v/v) als een niet-alkalische regeling gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met zacht schommelen. Spoel de membranen kort in ddH2O water, gevolgd door 6 keer 5 minuten wassen in PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20).OPMERKING: Was grondig. Blokkeer de membranen ‘s nachts in 5% magere melkblokkerende buffer (1x PBS, 0,1% Tween20). 6. Voer western blot uit Indien aangegeven, sonde met fluorescerend getagd Streptavidin (1:5000) en belastingscontrole, anti-GAPDH rhodamine (1:5000) in 5% BSA-blokkeringsbuffer (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) bij kamertemperatuur gedurende 45-60 minuten met zacht schommelen, in duisternis. Onderzoek de immunoprecipiteerde eiwitvlek eerst met primair anti-GFP-antilichaam in 5% magere melkblokkerende buffer, vervolgens met geschikte secundaire antilichamen in 5% BSA zoals in stap 6.1. Was de membranen gedurende 5 minuten in PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) in totaal vier herhalingen en spoel af met ddH2O water voordat u gaat fotograferen.

Representative Results

Het verschil in etiketteringsefficiëntie tussen verzeepte en niet-verzeepte (niet-sap) alkynylvetzuren voor detectie van klikchemie kan worden gevisualiseerd en vergeleken door de signaalintensiteit van vetgeacyleerde eiwitten via western blot (figuur 1). Een merkbaar effect werd waargenomen bij toenemende lengte van de acylketens. In cellen gelabeld met alkynyl-stearaat (alk-stear) verhoogde verzeping van het vetzuur en toediening met BSA voor metabole etikettering de detectie van S-geacyleerd eiwitsignaal drastisch door klikchemie en detectie door een fluorescerende azido-sonde (figuur 1, rechts), wat een algehele toename van cellulaire opname van het alkynylvetzuuretiket suggereert. Omgekeerd werd geen merkbaar verschil waargenomen in cellen die werden behandeld met het kortste en meest oplosbare vetzuur, alkynyl-myristaat (alk-myr; 13-tetradecyaanzuur of 13-TDYA). Cellen gelabeld met alkynyl-palmitaat (figuur 1, midden) vertoonden een tussentijdse toename in label in vergelijking met alkynyl-myristaat (13-TDYA), maar minder dan alkynyl-stearaat. Belangrijk is dat bij de behandeling van PVDF-membranen met 0,1 M KOH de vetzuuretiketten grotendeels werden verwijderd uit cellen geïncubeerd met alkynylpalmitaat en alkynyl-stearaat, wat bevestigt dat het grootste deel van het signaal door een ester- of thioesterbinding ging (figuur 1, midden en rechts, onderste panelen). Zoals verwacht was de opname van alkynyl-myristaat meestal alkaliresistent (figuur 1, links, onderste panelen), vanwege de hechting van myristaat aan eiwitten via een amidebinding. Figuur 2 toont de veelzijdigheid en gevoeligheid van klikchemie om vetacylatatie van immunoprecipiteerde eiwitten te detecteren. HEK293T-cellen werden getransfecteerd met myristoylated C-terminal huntingtine (HTT) gefuseerd met GFP (myr-ctHTT-GFP) en gelabeld met alkynyl-myristaat, zoals eerder beschreven18. Na immunoprecipitatie werd ctHTT-GFP uit de kralen vrijgegeven en onderworpen aan klikchemie naast de lysaten. Niet alleen werd myristoyatie van wildtype (WT) myr-ctHTT-GFP gedetecteerd in de immunoprecipitaten, maar het werd ook sterk gedetecteerd in de lysaten, terwijl de G2A-mutatie myristoylation van de ctHTT-GFP volledig blokkeerde (figuur 2). Figuur 1: Detectie van vetgeacyleerde eiwitten met behulp van klikchemie. HEK293T-cellen werden direct geïncubeerd met de aangegeven vetzuren (niet-sap) of na verzeping (sap) en incubatie met het dragereiwit BSA, zoals beschreven in protocol 2.1-2.7. Alkynyl-vetzuren werden gekoppeld aan fluorescerend azide door 100 μg eiwitlysaten te onderwerpen aan klikchemie, gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF-membranen. Na behandeling met 0,1 M Tris pH 7,0 of 0,1 M KOH, om thioesterbindingen om te keren, werd vetacylatatie gedetecteerd met behulp van een fluorescerend azide. GAPDH werd gebruikt als laadcontrole; anti-GAPDH rhodamine (1:5.000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Detectie van N-myristoylated ctHTT-GFP met behulp van klikchemie. HEK293T-cellen werden getransfecteerd met C-terminaal afgeknotte (ct) en myristoylatable vorm van HTT (myr-ctHTT-GFP) en gelabeld met alkynyl-myristaat. Een niet-myristolestabiele vorm met de essentiële glycine vervangen door een alanine werd opgenomen (G2A). Na het oogsten en lysis werd ctHTT-GFP immunoprecipiteerd met behulp van geiten anti-GFP. Lysaten werden onderworpen aan klikchemiereactie (links) en immunoprecipitaten na afgifte van de kralen. Myristoylation werd gedetecteerd met Streptavidin Alexa 680 (SA680). GFP werd gedetecteerd met behulp van konijn anti-GFP in combinatie met anti-konijn Alexa 488. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Workflowschema van experimenteel protocol. Workflowoverzicht van de belangrijkste experimentele stappen in het protocol. Er worden verschillende punten genoteerd waar het protocol kan worden gepauzeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Directe toevoeging van vetzuren aan cellen in cultuur kan leiden tot onoplosbaarheid, precipitatie van lipiden en lipotoxiciteit40. Bijgevolg kan het rechtstreeks toevoegen van vetzuren aan cellen niet alleen resulteren in een slechte cellulaire opname en lage beschikbaarheid van het vetzuuretiket, maar ook in een verminderd aantal levensvatbare cellen voor downstream-analyse, evenals activering van off-target pathways. Veel metabole etiketteringsprotocollen voor klikchemiedetectie omvatten echter directe toevoeging van vetzuren en een groot aantal palmitoyl-proteoomstudies met behulp van klikchemiedetectie tot op heden verzeept zelden de vetzuuretiketten of incubeer ze met BSA8,36. Het is belangrijk om rekening te houden met het feit dat de efficiëntie en gevoeligheid van klikchemiedetectie van vet-geacyleerde eiwitten afhankelijk zijn van voldoende cellulaire opname van de vetzuuranalogen. Daarom is het redelijk om te speculeren dat veel S-geacyleerde eiwitten mogelijk aan detectie in proteomische studies zijn ontsnapt vanwege een lage beschikbaarheid van de vetzuuretiketten door slechte opname in de cellen, vooral wanneer het vetzuur met de langere keten 17-ODYA werd gebruikt. 17-ODYA, of alkynyl-stearaat, is het meest gebruikte label bij uitstek voor verschillende studies vanwege de commerciële beschikbaarheid en het vroege gebruik8,36. De resultaten van dit protocol tonen echter aan dat verzeping van 17-ODYA resulteert in de grootste toename in de detectie van S-geacyleerde eiwitten, in vergelijking met vetzuren met een kortere keten zoals palmitaat of myristaat. Daarom kan het herhalen van deze experimenten met verzeepte labels extra substraten van S-acylering opleveren die mogelijk eerder over het hoofd zijn gezien. Verder, terwijl de meeste palmitoyl acyltransferases de voorkeur geven aan palmitaat voor S-acylering, hebben sommigen voorkeuren voor andere lengtes van vetzuren zoals stearaat15,38,44. Bovendien geven sommige eiwitten of zelfs specifieke plaatsen in eiwitten de voorkeur aan het ene vetzuur boven het andere15,45. Daarom kunnen studies met 17-ODYA een voorkeur hebben voor eiwitten S-acylated met stearaat, niet met palmitaat, terwijl ze die eiwitten ook ondervertegenwoordigd hebben vanwege een lagere detectie.

De verbeterde metabole etiketteringsefficiëntie voor klikchemie is afhankelijk van de verzeping van lipiden en incubatie met FAFBSA-stappen, evenals de gedelipide FBS. Alle vetzuren moeten volledig worden verzeept in KOH zonder zichtbare vaste stoffen voordat wordt overgegaan tot incubatie met FAFBSA. Dit kan een moeilijke stap zijn en timing is cruciaal. Nadat de verzeepte vetzuren in oplossing zijn gegaan bij 65 °C, voeg onmiddellijk warm BSA toe, omdat verdere verhitting zal leiden tot verdamping van de DMSO uit de vetzuren. Bovendien zal het verzeepte label opnieuw beginnen te stollen zodra het begint af te koelen. Daarom moet de FAFBSA warm zijn en snel worden toegevoegd nadat het zout oplosbaar is geworden. De glazen reactieflacons en hun vorm zijn belangrijk voor deze stap. Ze zorgen ervoor dat het verzeepte lipide warm genoeg is om oplosbaar te blijven, terwijl het koel genoeg is om ervoor te zorgen dat de FAFBSA niet stolt. Voldoende mengen via pipetteren is bij deze stap ook belangrijk om een homogene oplossing voor etikettering te garanderen.

De reagentia voor klikchemie moeten op de juiste manier worden opgeslagen, meestal met droogmiddelen of onder N2 – of Ar-gas bij -20 °C tot -80 °C. Gebrek aan acyleringssignaal of zwak signaal kan te wijten zijn aan onstabiele reagentia, met name oudere TBTA- en azide-stamoplossingen. Verder moet er voorzichtig worden omgegaan met fluorescerende azide-stamoplossingen, die zoveel mogelijk tegen licht moeten worden beschermd. Bovendien moeten variabelen zoals de methode van lipidedeprivatie en etiketteringstijd mogelijk worden getest om de optimale omstandigheden te bepalen, afhankelijk van het type cel dat wordt gebruikt. Neuronale cellen kunnen bijvoorbeeld langere labelingtijden nodig hebben omdat mediaveranderingen en lipidendeprivatie moeilijk zijn (ongepubliceerd).

Het voordeel van dit protocol is het meest dramatisch bij gebruik voor vetzuren met een langere keten. Voor kortere ketens wordt de toename van de signaalintensiteit minder dramatisch, maar is waarschijnlijk nog steeds beschermend voor de cellen. Hoewel de voorgestelde modificaties de detectie van eiwitacylering in het algemeen zullen verbeteren, wordt klikchemie nog steeds beschouwd als een lipidecentrische methode1 die beperkt is tot detectie van dynamisch, niet stabiel S-acyleerde eiwitten1. Andere beperkingen om te overwegen zijn onder meer de vereiste van vetzuurdeprivatie om etikettering te bevorderen, en het relatief beperkte bereik van compatibele celtypen in vergelijking met de acyl-biotine uitwisseling (ABE) detectie van S-acylatie16. Ondanks deze beperkingen is de detectie van klikchemie sneller dan de meeste acyluitwisselingstests en is deze beter geschikt voor de detectie van eiwitten die de herhaalde eiwitprecipitatiestappen die nodig zijn voor acyluitwisselingstests niet verdragen. Bovendien kan deze aanpak worden gecombineerd met gelijktijdige etikettering met behulp van andere kliktests zoals puls-achtervolgingsanalyse38.

Het gebruik van deze modificatie voor metabole etikettering voor klikchemie verhoogde de algehele detectie van geacyleerde eiwitten, met name S-acylated, met een verscheidenheid aan proteomische technieken die worden gebruikt in combinatie met klikchemie. Zoals getoond, kan fluorogene detectie worden gebruikt als alternatief voor biotine (figuur 1)28. Dit is vooral handig omdat er geen endogene fluorescerende eiwitten in de cellysaten zitten. Bovendien kunnen fluoroforen worden gebruikt die pas na klikchemie worden geactiveerd46. Het verzeepte en FAFBSA-gebonden vetzuur voor click chemistry labeling kan helpen bij het detecteren van eiwitten van belang vanwege een algehele toename van de hoeveelheid label die beschikbaar is in de cel en door het beperken van toxische effecten van het toevoegen van vetzuren rechtstreeks aan de media. Het kan ook worden gebruikt in combinatie met massaspectrometrie27 om de detectie van eiwitten met een lage abundantie te verhogen, vooral in combinatie met de recente vooruitgang met behulp van machine-learning-algoritmen die redundante metingen voorkomen om de gevoeligheid voor eiwitten met een lage abundantie te verhogen, in tegenstelling tot bestaande gegevensafhankelijke acquisitie die de detectie van de meest voorkomende eiwitten bevordert47 . Daarnaast kan klikchemie worden gecombineerd met stabiele isotoopetikettering met aminozuren in celkweek (SILAC) en pulsjachtmethoden om kwantificeerbare gegevens over dynamisch eiwit S-acylering27 te produceren. Ten slotte heeft de Hannoush-groep klikchemie gecombineerd met proximity ligation assay (PLA) om eencellige visualisatie en onderzoeken naar subcellulaire distributie van palmitoyleerde eiwitten mogelijk te maken43,48.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door de National Science and Engineering Research Council (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao werd gefinancierd door The Ram en Lekha Tumkur Memorial Scholarship via het Department of Biology aan de Universiteit van Waterloo, en de Lucy Morrison Memorial Bursary via IODE Ontario, naast de graduate onderzoeksfinanciering van de Universiteit van Waterloo, bestaande uit het Graduate Research Studentship (50503-11072), Science Graduate Award en Graduate Teaching Assistantship. De auteurs willen alle leden van het Martin-lab bedanken voor hun steun bij het voorbereiden van dit manuscript, met name Stephanie Ryall, Harleen Gill en Sadia Khan die in eerste instantie hebben geholpen bij het opzetten van het Martin Lab ter voorbereiding op deze studies. De auteurs willen ook Dr. Luc Berthiaume bedanken voor het vriendelijke geschenk van de ctHTT-GFP-constructies en Dr. Shaun Sanders voor de kritische input bij het voorbereiden van het manuscript. Figuur 3 is gemaakt met BioRender.com.

Materials

13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) Click Chemistry Tools 1164
15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) Click Chemistry Tools 1165
17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) Cayman Chemical Company 90270
30% acrylamide/bis solution 29:1 Biorad 1610156
96-well plate reader Biorad N/A
AFDye 647 azide plus Click Chemistry Tools 1482
Ammonium persulfate (APS) Biorad 1610700
Anti-GAPDH hFAB Rhodamine Biorad 12004167
Anti-rabbit Alexa 488 Invitrogen A11034
Anti-Tubulin hFAB Rhodamine Biorad 12004166
Biotin Azide Click Chemistry Tools 1265
Bis-tris, ultrapure VWR 715
Calcium chloride J.T. Baker 1332-1
Centrifuge 16,000xg, 4°C Thermo Scientific N/A
Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) Life Technologies A3382101
ChemiDoc Imager Biorad N/A
Copper sulfate (1 mM) VWR BDH9312
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate MP Biomedicals 102906
Detergent compatible (DC) assay Biorad N/A
Dimethyl sulfoxide (DMSO) VWR 0231-500 mL
DMEM, 1x Wisent Inc 319015CL
Ethanol, anhydrous N/A N/A
Fatty Acid Free BSA MP Biomedicals 219989950
Fast Blot Turbo Semi-dry transfer Biorad N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12483-020
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid VWR 5011
Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 VWR N/A
Igepal CA-630 Alfa Aesar J61055
Image Lab Software Biorad N/A
L-glutamine supplement solution Wisent Inc 609-065-EL
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214-500
Methanol VWR BDH1135
Myristic Acid (25 mM) VWR M0476-25G
Palmitic acid (100 mM) VWR P0002-25G
Penicillin-Streptomycin, 10x Wisent Inc 450201EL
Pepstatin A (synthetic) Enzo Life Sciences ALX-260-085-M005
Phenylmethylsulfonyl fluoride Enzo Life Sciences ALX-270-184-G005
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 VWR 75801-000
Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) Eusera EU4
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
Potassium hydroxide Ward's Science 470302-100
Rabbit polyclonal antibody to GFP Eusera EU1
Sodium chloride VWR 0241-1KG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Sodium pyruvate Wisent Inc 600-110-EL
Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate Thermo Fisher Scientific S21378
Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) Click Chemistry Tools 1061
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) Soltec Ventures M115
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypsin/EDTA Wisent Inc 325-043-CL
Tween 20 Reagent Grade 1L VWR 97062-332
WHEATON NextGen V Vials 3 mL VWR 89085-424
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Zaballa, M. E., vander Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 1-31 (2018).
  2. Martin, D. D. O., Beauchamp, E., Berthiaume, L. G. Post-translational myristoylation: Fat matters in cellular life and death. Biochimie. 93 (1), 18-31 (2011).
  3. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
  4. O’Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. The Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
  5. Liang, X., et al. Heterogeneous fatty acylation of Src family kinases with polyunsaturated fatty acids regulates raft localization and signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 276 (33), 30987-30994 (2001).
  6. Thinon, E., Percher, A., Hang, H. C. Bioorthogonal chemical reporters for monitoring unsaturated fatty-acylated proteins. ChemBioChem. 17 (19), 1800-1803 (2016).
  7. Veit, M., Reverey, H., Schmidt, M. F. G. Cytoplasmic tail length influences fatty acid selection for acylation of viral glycoproteins. Biochemical Journal. 318 (1), 163-172 (1996).
  8. Sanders, S. S., et al. Curation of the mammalian palmitoylome indicates a pivotal role for palmitoylation in diseases and disorders of the nervous system and cancers. PLOS Computational Biology. 11 (8), 1004405 (2015).
  9. Hannoush, R. N. Synthetic protein lipidation. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 39-46 (2015).
  10. Martin, D. D. O., Hayden, M. R. Post-translational myristoylation at the cross roads of cell death, autophagy and neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 43 (2), 229-234 (2015).
  11. Young, F. B., Butland, S. L., Sanders, S. S., Sutton, L. M., Hayden, M. R. Putting proteins in their place: Palmitoylation in Huntington disease and other neuropsychiatric diseases. Progress in Neurobiology. 97 (2), 220-238 (2012).
  12. Hansen, A. L., Mukai, K., Schopfer, F. J., Taguchi, T., Holm, C. K. Sting palmitoylation as a therapeutic target. Cellular & Molecular Immunology. 16 (3), 236-241 (2019).
  13. Veit, M. Palmitoylation of virus proteins. Biology of the Cell. 104 (9), 493-515 (2012).
  14. Jiang, H., et al. Protein lipidation: Occurrence, mechanisms, biological functions, and enabling technologies. Chemical Reviews. 118 (3), 919-988 (2018).
  15. Greaves, J., et al. Molecular basis of fatty acid selectivity in the zDHHC family of S-acyltransferases revealed by click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (8), 1365-1374 (2017).
  16. Gao, X., Hannoush, R. N. A decade of click chemistry in protein palmitoylation: Impact on discovery and new biology. Cell Chemical Biology. 25 (3), 236-246 (2018).
  17. Tsutsumi, R., Fukata, Y., Fukata, M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 456 (6), 1199-1206 (2008).
  18. Roth, A. F., Feng, Y., Chen, L., Davis, N. G. The yeast DHHC cysteine-rich domain protein Akr1p is a palmitoyl transferase. The Journal of Cell Biology. 159 (1), 23-28 (2002).
  19. Lobo, S., Greentree, W. K., Linder, M. E., Deschenes, R. J. Identification of a Ras Palmitoyltransferase in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41268-41273 (2002).
  20. Ohno, Y., Kihara, A., Sano, T., Igarashi, Y. Intracellular localization and tissue-specific distribution of human and yeast DHHC cysteine-rich domain-containing proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1761 (4), 474-483 (2006).
  21. Huang, K., et al. Huntingtin-interacting protein HIP14 Is a palmitoyl transferase involved in palmitoylation and trafficking of multiple neuronal proteins. Neuron. 44 (6), 977-986 (2004).
  22. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. BioTechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
  23. Roth, A. F., Wan, J., Green, W. N., Yates, J. R., Davis, N. G. Proteomic identification of palmitoylated proteins. Methods. 40 (2), 135-142 (2006).
  24. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2 (7), 1573-1584 (2007).
  25. Martin, D. D. O., et al. Rapid detection, discovery, and identification of post-translationally myristoylated proteins during apoptosis using a bio-orthogonal azidomyristate analog. The FASEB Journal. 22 (3), 797-806 (2007).
  26. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. The FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
  27. Martin, B. R., Wang, C., Adibekian, A., Tully, S. E., Cravatt, B. F. Global profiling of dynamic protein palmitoylation. Nature Methods. 9 (1), 84-89 (2012).
  28. Yap, M. C., et al. Rapid and selective detection of fatty acylated proteins using ω-alkynyl-fatty acids and click chemistry. Journal of Lipid Research. 51 (6), 1566-1580 (2010).
  29. Hang, H. C., Wilson, J. P., Charron, G. Bioorthogonal chemical reporters for analyzing protein lipidation and lipid trafficking. Accounts of Chemical Research. 44 (9), 699-708 (2011).
  30. Thinon, E., et al. Global profiling of co- and post-translationally N-myristoylated proteomes in human cells. Nature Communications. 5 (1), 4919 (2014).
  31. Charron, G., Wilson, J., Hang, H. C. Chemical tools for understanding protein lipidation in eukaryotes. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (4), 382-391 (2009).
  32. Hang, H. C., et al. Chemical probes for the rapid detection of fatty-acylated proteins in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 129 (10), 2744-2745 (2007).
  33. Heal, W. P., et al. Site-specific N-terminal labelling of proteins in vitro and in vivo using N-myristoyl transferase and bioorthogonal ligation chemistry. Chemical Communications. (4), 480-482 (2007).
  34. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  35. Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (ABE). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e50031 (2013).
  36. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein palmitoylation database. F1000Research. 4, 261 (2015).
  37. Heal, W. P., Wickramasinghe, S. R., Leatherbarrow, R. J., Tate, E. W. N -Myristoyl transferase-mediated protein labelling in vivo. Organic & Biomolecular Chemistry. 6 (13), 2308-2315 (2008).
  38. Lin, D. T. S., Conibear, E. ABHD17 proteins are novel protein depalmitoylases that regulate N-Ras palmitate turnover and subcellular localization. eLife. 4, 11306 (2015).
  39. Charron, G., et al. Robust fluorescent detection of protein fatty-acylation with chemical reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
  40. Alsabeeh, N., Chausse, B., Kakimoto, P. A., Kowaltowski, A. J., Shirihai, O. Cell culture models of fatty acid overload: Problems and solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (2), 143-151 (2018).
  41. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
  42. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6 (2), 135-138 (2009).
  43. Gao, X., Hannoush, R. N. Single-cell in situ imaging of palmitoylation in fatty-acylated proteins. Nature Protocols. 9 (11), 2607-2623 (2014).
  44. Muszbek, L., Haramura, G., Cluette-Brown, J. E., Cott, E. M. V., Laposata, M. The pool of fatty acids covalently bound to platelet proteins by thioester linkages can be altered by exogenously supplied fatty acids. Lipids. 34, 331-337 (1999).
  45. Brett, K., et al. Site-specific S-Acylation of influenza virus hemagglutinin. The location of the acylation site relative to the membrane border is the decisive factor for attachment of stearate. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34978-34989 (2014).
  46. Shieh, P., et al. CalFluors: A universal motif for fluorogenic azide probes across the visible spectrum. Journal of the American Chemical Society. 137 (22), 7145-7151 (2015).
  47. Pelletier, A. R., et al. MealTime-MS: A machine learning-guided real-time mass spectrometry analysis for protein identification and efficient dynamic exclusion. bioRxiv. , 110726 (2020).
  48. Gao, X., Hannoush, R. N. Method for cellular imaging of palmitoylated proteins with clickable probes and proximity ligation applied to Hedgehog, tubulin, and Ras. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4544-4550 (2014).

Tags

Alkynyl Fatty Acid AnalogsClick ChemistryFatty Acylated ProteinsFatty Acid LabelingMetabolic LabelingHEK-293 T-cellsBSA-bound Fatty AcidsSaponificationPotassium HydroxideFatty Acid-free BSA

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Liao, L. M. Q., Gray, R. A. V., Martin, D. D. O. Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry. J. Vis. Exp. (170), e62107, doi:10.3791/62107 (2021).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image