Creazione e manutenzione di una biobanca vivente - Come lo facciamo
Summary
Nel seguente lavoro, descriviamo i passaggi consecutivi necessari per la creazione di una grande biobanca di cancro colorettale e pancreatico.
Abstract
Alla luce della crescente conoscenza delle proprietà inter-individuali e dell’eterogeneità dei tumori, il campo emergente della medicina personalizzata richiede una piattaforma per la ricerca preclinica. Negli ultimi anni, abbiamo istituito una biobanca di tumori colorettali e pancreatici che comprende tessuto tumorale primario, tessuto normale, sieri, linfociti del sangue periferici isolati (PBL), xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), nonché linee cellulari tumorali primarie e secondarie. Poiché il tessuto tumorale originale è limitato e il tasso di determinazione delle linee cellulari primarie del cancro è ancora relativamente basso, il PDX consente non solo la conservazione e l’estensione della biobanca, ma anche la generazione di linee cellulari tumorali secondarie. Inoltre, i modelli PDX hanno dimostrato di essere il modello in vivo ideale per il test preclinico dei farmaci. Tuttavia, il biobanking richiede un’attenta preparazione, linee guida rigorose e un’infrastruttura ben sintonizzata. La colectomia, la duodenopancreatectomia o i campioni di metastasi resettati vengono raccolti immediatamente dopo la resezione e trasferiti al reparto di patologia. Rispettando la priorità di un rapporto istopatologico imparziale, a discrezione del patologo presente che effettua le dissezioni, vengono raccolti piccoli pezzi tumorali e tessuto non tumorale.
Le parti necrotiche vengono scartate e il tessuto tumorale rimanente viene tagliato in piccoli cubi identici e crioconservato per un uso successivo. Inoltre, una piccola parte del tumore viene macinata e tesa per la coltura primaria delle cellule tumorali. Inoltre, i campioni di sangue prelevati dal paziente in modo pre e postoperatorio, vengono elaborati per ottenere siero e PBL. Per l’innesto PDX, gli esemplari crioconservati vengono scongelati e impiantati per via sottocutanea nei fianchi di topi immunodifesa. Il PDX risultante ricapitola strettamente l’istologia dei tumori “donatori” e può essere utilizzato per successive xenointetizzazioni o crioconservati per un uso successivo. Nel seguente lavoro, descriviamo le singole fasi di creazione, manutenzione e somministrazione di una grande biobanca di cancro colorettale e pancreatico. Inoltre, evidenziamo i dettagli cruciali e gli avvertimenti associati al biobanking.
Introduction
Negli ultimi anni, la conoscenza accumulata delle proprietà morfologiche, cliniche e genetiche dei tumori ha portato alla concezione del cancro come malattia eterogenea e individuale. Di conseguenza, la caratterizzazione mutazionale delle neoplasie, oltre alle caratteristiche cliniche e patologiche, ha acquisito importanza per il processo decisionale clinico e sono state sviluppate molte terapie mirate per varie alterazioni molecolari. Ad esempio, l’efficacia del cetuximab nel trattamento del cancro delcolon-rettopuò essere prevista dall’analisi dello stato mutazionale KRAS e PIK3CA 1 . La medicina di precisione mira a un approccio su misura per fornire la massima risposta al trattamento in ogni paziente ed evitare la tossicità delle terapie inefficaci2. Le biobanche contengono tessuti, sangue e altri materiali biologici dei pazienti oncologici, che sono collegati ai dati clinici, e quindi sono uno strumento eccellente per la ricerca traslizionale sul cancro. A causa del gran numero di campioni clinici, le biobanche consentono il rilevamento di mutazioni rare, ma potenzialmente drogabili, che offrono nuove opportunità di trattamento per ilsingolo paziente 3.
Per coprire il più ampio possibile uno spettro di ricerca oncologica, non abbiamo limitato la nostra attività sulla raccolta dei campioni da soli, ma ci siamo concentrati sulla creazione di linee cellulari tumorali derivate dal paziente e xenografti (PDX). Le linee cellulari 2D tradizionali rimangono la pietra d’angolo della ricerca in vitro e sono la scelta principale per gli screening farmacologici su larga scala4,5. Inoltre, l’analisi della linea cellulare è spesso più semplice, più economica e più facilmente disponibile. Inoltre, poiché sono disponibili linfociti del sangue periferici derivati dal paziente (PBL), anche l’immunologia tumorale può essere studiata in vitro6. Tuttavia, la maggior parte dei farmaci di nuova sviluppo con promettente efficacia preclinica in esperimenti in vitro o in vivo a base cellulare, hanno mostrato risultati deludenti negli studi clinici7. Al contrario, studi preclinici basati su studi in vivo PDX hanno rispecchiato l’attività clinica degli agenti antineoplastici molto più fedelmente8. Poiché il tessuto PDX riflette da vicino le proprietà istologiche e molecolari del tumore donatore, i modelli PDX sono un buon modo per propagare le quantità spesso molto limitate di tessuto tumorale vitale per mantenere l’integrità di una biobanca e consentire lo scambio di campioni tra gruppi di ricerca e istituzioni. Inoltre, le linee cellulari tumorali derivate dal tessuto PDX possono essere stabilite in modo significativamente più semplice rispetto alle linee cellulari primariedel cancro 9. Negli ultimi anni, il nostro gruppo di lavoro ha istituito una biobanca integrata completa per il cancro del colon-retto e del pancreas, standardizzando e ottimizzando gradualmente il flusso di lavoro per tutti i campioni biologici in questione (Figura 1).
Figura 1: Flusso di lavoro e organizzazione della biobanca Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generazione di una biobanca vivente presuppone, oltre a rispettare le norme giuridiche in materia di privacy, diritto medico e benessere degli animali, una buona infrastruttura e un team ben coordinato. Si è dimostrato vantaggioso coinvolgere direttamente una parte del personale chirurgico nelle procedure di ricerca, poiché possono valutare molto bene l’idoneità del singolo paziente alla donazione di tessuti. Inoltre, i pazienti tendono a acconsentire con il biobanking più frequentemente, quando la loro approvazione scritta viene ottenuta nel corso della discussione sul consenso informato chirurgico. Per risparmiare tempo e risorse, i casi che presumibilmente produrranno quantità insufficienti di tessuto tumorale non dovrebbero essere selezionati per il biobanking. Quando si tratta di acquisizione di campioni, la massima “la comunicazione è la chiave” è una verità semplice, ma spesso trascurata. Ci vuole solo un singolo infermiere teatrale disinformato o un collega chirurgico per rovinare l’esemplare fin dall’inizio procedendo come al solito e aggiungendo formaldeide al campione di resezione. Pertanto, è assolutamente fondamentale che ogni singolo membro del personale coinvolto faccia conoscenza della SOP per il biobanking. I chirurghi dovrebbero essere notati il giorno prima e proprio all’inizio della procedura sulla raccolta programmata dei tessuti. Inoltre, i casi selezionati per il biobanking dovrebbero essere evidenziati nel piano or elettronico. La raccolta dei tessuti dal campione chirurgico deve essere eseguita da un patologo. In primo luogo, ciò garantirà che la raccolta dei tessuti non interferisca con la relazione patologica finale. In secondo luogo, ciò aumenta la probabilità di ricevere tessuti con quantità adeguate di tessuto tumorale vitale. Soprattutto nei tumori pancreatici con una pronunciata reazione desmoplastica e frequenti aree necrotiche, le parti vitali sono difficili da identificare macroscopicamente per l’occhio non addestrato. Come eccezione a questa regola, i blocchi di tessuto da grandi metastasi epatiche o polmonari, possono a volte essere asportati “back-table” dal chirurgo, se i margini chirurgici possono essere definiti macroscopicamente. Il cancro rettale resected per escissione mesorettale totale (TME), potrebbe non essere adatto per il biobanking, poiché la raccolta dei tessuti dal campione reinsediato prima dell’incorporamento della paraffina potrebbe interferire con la valutazione della qualità TME. In alternativa, i tessuti per il biobanking possono essere acquisiti mediante biopsia transanale del cancro rettale.
I tassi di stabilimento per le colture cellulari primarie derivate dal tumore originale sono generalmente bassi. È più probabile che le colture di cellule secondarie derivate da PDX vengano stabilite con successo. Si consiglia di testare diversi supporti per ogni caso e l’uso di integratori antibiotici per i primi passaggi per ridurre al minimo la contaminazione poiché il tessuto raccolto è raramente sterile. Dopo una propagazione riuscita, ogni singola linea cellulare deve essere confermata come linea cellulare tumorale dall’analisi FACS e regolarmente testata per la contaminazione da micoplasma. Per escludere la contaminazione incrociata, è consigliabile un’analisi STR regolare. Va notato che il protocollo di stabilimento per le linee cellulari primarie e secondarie è costantemente soggetto a ottimizzazione. I dettagli relativi alla composizione e ai tassi di successo dei singoli mezzi di comunicazione esulano chiaramente dall’ambito di questo lavoro e saranno pubblicati separatamente.
Per l’innesto PDX, il tessuto tumorale può essere impiantato direttamente dopo la resezione o crioconservato nel siero fetale del calvo con DMSO al 10% o mezzi di congelamento simili per l’impianto ritardato. L’impianto immediatamente dopo la raccolta dei tessuti tumorali mette a dura prova la logistica e il personale di laboratorio e i risultati di xenografting dopo la crioconservazione non sono affatto inferiori a 10. Inoltre, l’incubazione del tessuto in Matrigel prima dell’impianto tumorale, aumenta significativamente i tassi di innesto12. Si consiglia l’innesto ritardato a seguito di una definitiva scoperta patologica e dello smaltimento immediato di campioni di tessuto raccolti erroneamente. Poiché il tasso di successo dell’innesto primario aumenta con l’immunodeficienza del topo ricevente, tendiamo a utilizzare topi NSG per il primo passaggio PDX. Dopo il primo accinnesto PDX di successo, i topi NMRInu/nu possono e devono essere utilizzati per passaggi successivi ed espansione dei tessuti. Questo ceppo è più robusto, più economico e più facile da allevare rispetto all’NSG o a ceppi immunodifesa simili, ma mostra ancora tassi di innesto ragionevoli. Inoltre, la sua nudità facilita l’impianto e il monitoraggio della crescita tumorale. Per aumentare i tassi di innesto nei passaggi successivi, si consiglia il trasferimento diretto di tessuti PDX appena raccolti per ospitare topi quando possibile, specialmente per pdx a crescita lenta e casi con un basso tasso di successo dell’innesto primario. Collins e Lang hanno recentemente esaminato 14 studi sull’istituzione del PDX colorettale e hanno riportato tassi di innesto che variano dal 14 al 100% con un tasso medio di stabilimento PDX del 68%, quest’ultimo coerente con i nostririsultati 13. In linea con la letteratura, abbiamo osservato tassi di stabilimento più bassi di pancreas rispetto al cancro del colon-retto PDX14. Indipendentemente dal ceppo del topo ospite e dall’entità tumorale, la crescita dei linfomi delle cellule B associati al virus Epstein-Barr (EBV) umani e dei linfomi murini sul lato dell’impianto pone un’insidiaimportante 15,16. Se non riconosciuti, tali tumori possono “contaminare” i passaggi successivi e quindi confondere risultati consecutivi. Insolita crescita rapida del PDX e gonfiore dei linfonodi cervicali, ascellari e inguinali sono forti indicatori della crescita del linfoma murino, ma è comunque consigliabile un esame istologico regolare della PDX. Inoltre, la concordanza genetica tra pdx e il corrispondente paziente donatore deve essere testata regolarmente mediante analisi STR. Idealmente, la biobanca dovrebbe essere collegata a una banca dati clinica che comprenda le caratteristiche dei pazienti (informazioni generali, sopravvivenza, sopravvivenza libera recidiva, terapia, neoplasia secondaria, ecc.). A causa delle normative legali sulla protezione della privacy e della mancanza di una base di dati così anonima, il nostro set di dati clinici viene regolarmente amministrato e aggiornato manualmente dai medici che collaborano.
Mentre le biobanche convenzionali sono limitate alla ricerca degli osservatorio, una biobanca vivente offre l’opportunità di interventi in vitro e in vivo. Le linee cellulari derivate dal paziente sono uno strumento importante per la ricerca fondamentale, gli screening dei farmaci ad alta produttività e la valutazione di nuovi agentifarmaceutici 4. I corrispondenti modelli PDX, tuttavia, sono sempre più importanti, poiché ricapitolano da vicino l’istologia del tumore originale17,18 e mostrano un’elevata stabilità genetica su diversipassaggi 19,20. La nostra biobanca PDX si è dimostrata un’ottima piattaforma per la ricercapreclinica e fondamentale 6,21. Inoltre, poiché le grandi collezioni PDX riflettono adeguatamente l’eterogeneità inter-individuale della popolazione del paziente, l’approccio dello studio clinico PDX (PCT) (un animale per modello per trattamento) ha acquisito importanza per lo sviluppo del farmaco poiché consente la previsione fedele della risposta clinica a nuovi farmaci e al regime combinatorio8. Attualmente stiamo anche valutando nuovi farmaci sperimentali in piccoli studi PCT.
Nonostante questi risultati promettenti, la durata mediana dello stabilimento di 12,2 mesi, impedisce l’applicabilità clinica dei modelli PDX come “topi avatar” per testare le opzioni di trattamento antitumorale, almeno per quei pazienti che hanno bisogno di un trattamento adiuvante immediato o addirittura neoadiuvante22. Un ulteriore svantaggio dei modelli PDX standard è la mancanza di usabilità per i test di immunoterapia a causa dell’immunodeficienza dei topi ospiti. Per superare questi limiti, sono stati sviluppati diversi ceppi di topi “umanizzati”. Questi topi sono fortemente immunocompromessi, ma possono essere ricostituiti con vari tipi di cellule derivate dal midollo osseo umano o cellule staminali ematopoietiche cd34+ successive alla crescita del PDX23,consentendo la valutazione della citotossicità mediata dai linfociti e della risposta terapeutica al trattamento inibitore del checkpoint immunitario24,25.
Negli ultimi anni, gli organoidi derivati dal paziente (DOP) sono emersi come importanti modelli di cancro in competizione con la PDX. Derivate da pezzi tumorali intatti e coltivate in un’impalcatura a matrice extracellulare, queste strutture tridimensionali riflettono da vicino le proprietà istologiche e genetiche del tumore originale. La possibilità di espansione e crioconservazione a lungo termine rende dop un integratore ideale di una biobancavivente 26,27. Oltre a un tasso di stabilimento relativamente elevato, è stata segnalata una previsione affidabile della risposta ai farmaci per la DOP di diverse entitàtumorali 28. Inoltre, le DOP sono state persino generate da cellule tumorali circolanti ed è anche possibile la creazione simultanea di organoidi dal tessuto sano corrispondente, consentendo la valutazione della tossicità correlata alla terapia su basepaziente-individuale 29,30. Tuttavia, rispetto alle colture cellulari 2D convenzionali, la coltura organoide richiede tempo e risorse e i composti artificiali della matrice extracellulare possono interferire con alcune procedure analitiche31. Inoltre, gli organoidi del cancro sono suscettibili alla crescita troppo da organoidi a crescita più rapida e non maligni derivati da epitelio sano30. A causa della mancanza di stroma, vasi sanguigni e cellule immunitarie, le DOP sono per lo più inapplicabili per il test di agenti immunoterapici antiangiogenetici. Tuttavia, i nuovi metodi di coltivazione consentono la modellazione del microambiente tumorale in vitro,rendendo le DOP un vero concorrente per i modelli PDX32. Nel prossimo futuro, i modelli tumorali pazienti-individuali, combinati con potenti strumenti genetici come il sequenziamento di nuova generazione, si spera aprano la strada a una vera medicina di precisione e approcci di trattamento su misura.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prendiamo gentilmente atto di Jenny Burmeister, la nostra assistente grafica, per la registrazione e l’editing del video. Inoltre, ringraziamo i nostri colleghi del reparto chirurgico e patologico per la collaborazione di lunga data. Ringraziamo anche Marcus Müller, responsabile della produzione dell’IT and Media Centre dell’Università di Rostock, per aver fornito le apparecchiature di registrazione audio e perfezionato la qualità del suono.
FINANZIAMENTO: La Fondazione tedesca per l’aiuto al cancro (DKH e.V.), la sovvenzione numero 108446 e il numero di sovvenzione TBI-V-1-241-VBW-084 dello stato Meclemburgo-Pomerania Anteriore hanno parzialmente finanziato questa ricerca.
Materials
| Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
| PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
| PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
| BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
| Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
| serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
| Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
| DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
| Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
| DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
| FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
| L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
| Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
| Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | — | cell freezing |
| cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
| 6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
| Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
| sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
| BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
| cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
| CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
| Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
| Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
| Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
| Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
| Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
| incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
| heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | — | heating |
| Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
| Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | — | sterile working bench |
| freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | — | sample storage |
| Electronic balance MP-300 | Chyo | — | Scale |
| BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
| Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
| Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
| GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
| ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | — | RFID chip |
| Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
| Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | — | heating |
| Heating lamp | Electric Petra, Burgau | — | heating |
| Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
| anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
| surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
| scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
| needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
| Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
| Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
| Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
| gauze swap Gazin®; steril; 10×10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
| Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
| Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
| iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
| MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
| Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
| Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | — | sample organization |
| Zebra TLP 2844 printer | Zebra | — | label printer |
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