Представлен протокол идентификации и количественного определения основных классов водорастворимых метаболитов в дрожжевых Saccharomyces cerevisiae. Описанный метод является универсальным, надежным и чувствительным. Позволяет отделить структурные изомеры и стереоизомерные формы водорастворимых метаболитов друг от друга.
Метаболомика – это методология, используемая для идентификации и количественной оценки многих низкомолекулярных промежуточных продуктов и продуктов метаболизма в клетке, ткани, органе, биологической жидкости или организме. Метаболомика традиционно фокусируется на водорастворимых метаболитах. Водорастворимый метаболом является конечным продуктом сложной клеточной сети, которая объединяет различные геномные, эпигеномные, транскриптомные, протеомные и экологические факторы. Следовательно, метаболомический анализ непосредственно оценивает результат действия для всех этих факторов во множестве биологических процессов в различных организмах. Одним из таких организмов является почкование дрожжей Saccharomyces cerevisiae,одноклеточный эукариот с полностью секвенированным геномом. Поскольку S. cerevisiae поддастся всестороннему молекулярному анализу, он используется в качестве модели для препарирования механизмов, лежащих в основе многих биологических процессов в эукариотической клетке. Универсальный аналитический метод для надежной, чувствительной и точной количественной оценки водорастворимого метаболома обеспечит необходимую методологию для анализа этих механизмов. Здесь представлен протокол оптимизации условий гашения метаболической активности и извлечения водорастворимых метаболитов из клеток S. cerevisiae. Протокол также описывает использование жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа экстрагированных водорастворимых метаболитов. Описанный здесь метод нецелевой метаболомики LC-MS/MS является универсальным и надежным. Это позволяет идентифицировать и количественно оценить более 370 водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами, включая различные структурные изомеры и стереоизомерные формы этих метаболитов. Эти метаболиты включают различные молекулы-носители энергии, нуклеотиды, аминокислоты, моносахариды, промежуточные продукты гликолиза и промежуточные продукты трикарбоксового цикла. Метод нецелевой метаболомики LC-MS/MS чувствителен и позволяет идентифицировать и количественно оценить некоторые водорастворимые метаболиты в концентрациях до 0,05 пмоль/мкл. Метод успешно используется для оценки водорастворимых метаболомов диких и мутантных дрожжевых клеток, культивированных в различных условиях.
Водорастворимые метаболиты представляют собой низкомолекулярные промежуточные продукты и продукты метаболизма, которые способствуют необходимым клеточным процессам. Эти эволюционно сохраненные процессы включают преобразование питательных веществ в пригодную для использования энергию, синтез макромолекул, клеточный рост и передачу сигналов, контроль клеточного цикла, регуляцию экспрессии генов, реакцию на стресс, посттрансляционную регуляцию метаболизма, поддержание функциональности митохондрий, везикулярный клеточный транспорт, аутофагию, клеточное старение и регулируемую гибель клеток1,2,3.
Многие из этих важных ролей водорастворимых метаболитов были обнаружены исследованиями в почковых дрожжах S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Этот одноклеточный эукариот является полезным модельным организмом для рассечения механизмов, с помощью которых водорастворимые метаболиты способствуют клеточным процессам благодаря своей податливости передовым биохимическим, генетическим и молекулярно-биологическим анализам23,24,25,26. Хотя методы нецелевой метаболомики LC-MS/MS были использованы для изучения роли водорастворимых метаболитов в почковых дрожжах3,18,22,27,этот тип анализа требует улучшения его универсальности, надежности, чувствительности и способности различать различные структурные изомеры и стереоизомерные формы этих метаболитов.
Последние годы отмечены значительными успехами в применении методов нецелевой метаболомики LC-MS/MS для профилирования водорастворимых метаболитов in vivo. Тем не менее, многие проблемы в использовании этой методологииостаются2,28, 29,30, 31,32,33,34,35,36. Эти проблемы включают в себя следующее. Во-первых, внутриклеточные концентрации многих водорастворимых метаболитов ниже порога чувствительности для применяемых в настоящее время методов. Во-вторых, эффективность гашения метаболической активности слишком низка, а степень связанной с гашением клеточной утечки внутриклеточных метаболитов слишком высока для современных методов; следовательно, используемые в настоящее время методы недооценивают внутриклеточные концентрации водорастворимых метаболитов. В-третьих, существующие методы не могут дифференцировать структурные изомеры (т.е. молекулы с одинаковой химической формулой, но разной атомной связностью) или стереоизомеры (т.е. молекулы с одинаковой химической формулой и атомной связностью, но с разным расположением атомов в пространстве) конкретных метаболитов; это препятствует правильной аннотации некоторых метаболитов используемыми в настоящее время методами. В-четвертых, существующие масс-спектральные онлайн-базы данных родительских ионов (MS1) и вторичных ионов (MS2) являются неполными; это влияет на правильную идентификацию и количественное определение конкретных метаболитов с использованием необработанных данных LC-MS/MS, полученных с помощью современных методов. В-пятых, существующие методы не могут использовать один тип экстракции метаболитов для восстановления всех или большинства классов водорастворимых метаболитов. В-шестых, существующие методы не могут использовать один тип колонки LC для отделения друг от друга всех или большинства классов водорастворимых метаболитов.
Здесь мы оптимизировали условия для гашения метаболической активности в клетках S. cerevisiae, поддержания большинства водорастворимых метаболитов в этих клетках перед экстракцией и извлечения большинства классов водорастворимых метаболитов из дрожжевых клеток. Мы разработали универсальный, надежный и чувствительный метод идентификации и количественной оценки более 370 водорастворимых метаболитов, извлеченных из клеток S. cerevisiae на основе LC-MS/MS. Этот метод нецелевой метаболомики позволяет оценить внутриклеточные концентрации различных молекул-энергоносителей, нуклеотидов, аминокислот, моносахаридов, промежуточных продуктов гликолиза и промежуточных продуктов трикарбоксового цикла. Разработанный метод LC-MS/MS позволяет идентифицировать и количественно оценить различные структурные изомеры и стереоизомерные формы водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами.
Чтобы успешно использовать описанный здесь протокол, следуйте профилактическим мерам, описанным ниже. Хлороформ и метанол извлекают различные вещества из лабораторной пластичной посуды. Поэтому относитесь к ним с осторожностью. Избегайте использования пластмасс на этапах, которые в?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Титоренко за дискуссии. Мы выражаем признательность Центру биологических применений масс-спектрометрии, Центру структурной и функциональной геномики и Центру микроскопии и клеточной визуализации (все в Университете Конкордия) за выдающиеся услуги. Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады (RGPIN 2014-04482 и CRDPJ 515900 – 17). K.M. был поддержан стипендией Арманда К. Аршамбо Университета Конкордия и премией декана университета Конкордия за выдающиеся достижения.
Chemicals | |||
Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
L-histidine | Sigma | H8125 | |
L-leucine | Sigma | L8912 | |
L-lysine | Sigma | L5501 | |
Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
Uracil | Sigma | U0750 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Hardware equipment | |||
500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
Digital thermometer | Omega | HH509 | |
Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
Laboratory materials | |||
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
Software | |||
Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
Yeast strain | |||
Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |