単一の卵母細胞レポーターアッセイを用いたインビトロ成熟時の母体母体翻訳プログラムの定義
Summary
このプロトコルは、 インビトロ 成熟時の単一卵母細胞におけるmRNA翻訳の調節を研究するためのレポーターアッセイを記述する。
Abstract
卵母細胞核成熟に関連する事象がよく記載されている。しかし、トティポテンシーの受精と獲得に備えて細胞質に起こる分子経路やプロセスについては、あまり知られていない。卵母細胞成熟の間、遺伝子発現の変化は、転写ではなく母体メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳と分解のみに依存する。従って、翻訳プログラムの実行は、胚の発達を維持するための卵母細胞の発達能力を確立する上で重要な役割を果たす。この論文は、meiotic成熟時および卵母細胞間遷移時に行われる母体母体翻訳のプログラムの定義に焦点を当てる。本方法論文では、 インビトロ 卵母細胞成熟中の標的mRNAの翻訳の調節を研究する戦略を提示する。ここでは、Ypetレポーターが目的の遺伝子の3’未翻訳領域(UTR)に融合し、注入された体積を制御するためにmCherryのためにポリアデニル化mRNAコードと共に卵母細胞にマイクロインジェクターを注入する。タイムラプス顕微鏡を使用してレポーターの蓄積を測定することにより、卵母細胞系精密成熟中の異なる遷移で翻訳速度が計算されます。ここでは、卵母細胞の単離および注入、タイムラプス記録、およびデータ分析のためのプロトコルについて、Ypet/interleukin-7(IL-7)-3’UTRレポーターを例として用いて説明した。
Introduction
完全に成長した哺乳類の卵母細胞は、受精およびトティポテンシーの獲得に備えて急速な変化を起す。これらの変化は、受精後の胚発生を維持するために不可欠である。核成熟に関連する事象は比較的よく記述されているが、卵母細胞質における分子プロセスおよび経路についてはあまり知られていない。卵母細胞成熟の最終段階では、卵母細胞は転写的に静かであり、遺伝子発現はmRNA翻訳と分解1,2に完全に依存する。したがって、発達能力に重要なタンパク質の合成は、卵母細胞の成長1,3の間に先に合成された長命mRNAの時限翻訳のプログラムに依存する。このプログラムの定義に焦点を当てたのは、meiotic成熟中および卵母細胞間遷移中に実行される母体母体翻訳のこのプログラムの定義に焦点を当て、この論文は、インビトロのmeiotic成熟の間に単一の卵母細胞における標的母性母体の翻訳の活性化と抑制を研究する戦略を提示する。
この方法では、YPetオープンリーディングフレームは、対象のトランスクリプトの3’UTRの上流にクローン化される。次に、このレポーターをコードするmRNAは、注入された体積を制御するためにmCherryをコードするポリアデニル化mRNAと共に卵母細胞にマイクロインジェクションされる。レポーター蓄積は、タイムラプス顕微鏡を用いた インビトロ 卵母細胞の精密成熟の間に測定される。黄色蛍光タンパク質(YFP)とmCherryの蓄積は、個々の卵母細胞に記録され、YFP信号は、共注入されたmCherryの高原レベルによって補正されます。データ取得後、カーブフィッティングにより得られた曲線の傾きを計算することにより、 インビトロ 卵母細胞の滑間成熟時に異なる時間間隔で翻訳速度を計算します。
このアプローチは、選択された内因性mRNAの翻訳の変化を実験的に確認するためのツールを提供します。また、この方法は、3’UTRの標的mRNA4,5,6のシス調節要素を操作することにより、卵母細胞の微細成熟時に翻訳を制御する調節要素の特性評価を容易にする。ポリ(A)尾長の操作はまた卵母細胞のアデニラーゼ/デアデニラーゼ活性への洞察を可能にする 5.シス作用要素またはRNA免疫沈降の変異生成は、同結合RNA結合タンパク質6,7との相互作用を研究するために使用することができる。さらに、この方法は、oocyteの品質が低下したモデルでターゲット3’UTR翻訳を測定することによって、卵子発達能力に不可欠な翻訳プログラムの必須成分を同定するために使用することができる8、9、10。この方法論文は、21日齢のC57/BL6マウスの裸卵母細胞がIL-7の3’UTRに融合したイペット記者とマイクロ注入された代表的な実験を提示する。卵母細胞注入、タイムラプス記録、およびデータ分析のためのセットアップおよびプロトコルについて説明した。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示された方法は、インビトロ卵母細胞のmeiotic成熟中に異なる遷移における標的mRNAの翻訳の活性化および抑制を研究する戦略を記述する。IL-7は、卵母細胞-cumulus細胞通信8,13に関与し得る卵母細胞によって放出されるサイトカインを、この方法を記述する目的で選択した。IL-7は卵母細胞成熟8中にますます翻訳されることが…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH R01 GM097165、GM116926、ユーニス・ケネディ・シュリバーNICHD国立生殖・不妊研究センターP50 HD055764からマルコ・コンティに支援されました。エンリコ・M・ダルデッロはラロール財団のフェローシップによって支援され、ナタシャ・G・J・コスターマンスはオランダ科学研究機構(NWO)のルビコン・フェローシップによって支援されました。
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
Referenzen
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