Definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno durante la maturazione in vitro utilizzando un saggio single oocyte reporter
Summary
Questo protocollo descrive un saggio di reporter per studiare la regolazione della traduzione dell’mRNA in singoli ovociti durante la maturazione in vitro.
Abstract
Gli eventi associati alla maturazione nucleare degli ovocite sono stati ben descritti. Tuttavia, molto meno si sa delle vie molecolari e dei processi che si svolgono nel citoplasma in preparazione alla fecondazione e all’acquisizione della totipotenza. Durante la maturazione degli ovocite, i cambiamenti nell’espressione genica dipendono esclusivamente dalla traduzione e dal degrado degli RNA messaggeri materni (mRNA) piuttosto che dalla trascrizione. L’esecuzione del programma trascizionale, quindi, svolge un ruolo chiave nello stabilire la competenza allo sviluppo degli ovocite per sostenere lo sviluppo degli embrioni. Questo articolo fa parte di un focus sulla definizione del programma di traduzione dell’mRNA materno che avviene durante la maturazione meiotica e alla transizione tra ovocita e zigote. In questo documento di metodo viene presentata una strategia per studiare la regolazione della traduzione degli mRNA bersaglio durante la maturazione degli ovocite in vitro. Qui, un reporter Ypet viene fuso alla regione non tradotta 3 ‘ (UTR) del gene di interesse e quindi micro-iniettato in ovociti insieme alla codifica dell’mRNA poliadenilato per mCherry per controllare il volume iniettato. Utilizzando la microscopia time-lapse per misurare l’accumulo del reporter, i tassi di traduzione sono calcolati a diverse transizioni durante la maturazione meiotica degli ovocite. Qui, sono stati descritti i protocolli per l’isolamento e l’iniezione degli ovocite, la registrazione time-lapse e l’analisi dei dati, usando il reporter UTR Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3’ come esempio.
Introduction
Un ovocita di mammiferi completamente cresciuto subisce rapidi cambiamenti nella preparazione alla fecondazione e all’acquisizione della totipotenza. Questi cambiamenti sono essenziali per sostenere lo sviluppo embrionale dopo la fecondazione. Sebbene gli eventi associati alla maturazione nucleare siano relativamente ben descritti, molto meno si sa dei processi molecolari e delle vie nel citoplasma degli ovocite. Durante le fasi finali della maturazione degli ovociti, gli ovociti sono trascrittamente silenziosi e l’espressione genica dipende interamente dalla traduzione e dalladegradazione dell’mRNA 1,2. La sintesi di proteine critiche per la competenza allo sviluppo, quindi, si basa su un programma di traduzione a tempo di mRNA di lunga durata che sono stati sintetizzati in precedenza durante la crescita degli ovocite1,3. Come parte di un focus sulla definizione di questo programma di traduzione dell’mRNA materno eseguito durante la maturazione meiotica e alla transizione tra ovociti e zigoti, questo documento presenta una strategia per studiare l’attivazione e la repressione della traduzione degli mRNA materni bersaglio in singoli ovociti durante la maturazione meiotica in vitro.
In questo metodo, il frame di lettura aperto YPet viene clonato a monte dell’UTR 3 ‘ della trascrizione di interesse. Successivamente, gli mRNA che codificano questo reporter vengono micro-iniettati in ovociti insieme a mRNA poliadenylati che codificano mCherry per controllare il volume iniettato. L’accumulo di reporter viene misurato durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro utilizzando la microscopia time-lapse. L’accumulo di proteine fluorescenti gialle (YFP) e mCherry è registrato nei singoli ovociti, e i segnali YFP sono corretti dal livello stabilizzato della mCherry co-iniettata. Dopo l’acquisizione dei dati, i tassi di traslazione sono calcolati per intervalli di tempo diversi durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro calcolando la pendenza della curva ottenuta mediante raccordo a curva.
Questo approccio fornisce uno strumento per confermare sperimentalmente i cambiamenti nella traduzione di mRNA endogeni selezionati. Inoltre, questo metodo facilita la caratterizzazione di elementi normativi che controllano la traslazione durante la maturazione meiotica degli ovocite manipolando gli elementi cis-regolatori dell’UTR 3′ degli mRNA target4,5,6. La manipolazione della lunghezza della coda poli(A) consente anche di comprendere l’attività dell’adenilasi/deadenylasi negli ovociti5. La mutagenesi degli elementi ad azione cis o l’immunoprecipitazione dell’RNA possono essere utilizzate per studiare le interazioni con le proteine leganti l’RNAimparentate 6,7. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per identificare componenti essenziali del programma di traduzione che sono fondamentali per la competenza allo sviluppo degli ovocite misurando la traduzione UTR target 3′ nei modelli associati alla riduzione della qualità degli ovocite 8,9,10. Questo documento di metodo presenta un esperimento rappresentativo in cui ovociti denudati di topi C57/BL6 di 21 giorni sono stati micro-iniettati con un reporter Ypet fuso all’UTR 3′ di IL-7. Sono stati descritti l’impostazione e il protocollo per l’iniezione di ovocite, la registrazione time-lapse e l’analisi dei dati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo presentato descrive una strategia per studiare l’attivazione e la repressione della traduzione dell’mRNA bersaglio in diverse transizioni durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro. IL-7, una citochina rilasciata dall’ovocito che può essere coinvolta nella comunicazione cellulare ovocita-cumulo8,13, è stata scelta allo scopo di descrivere questo metodo. IL-7 è noto per essere sempre più tradotto durante la maturazione degli ovoc…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM097165, GM116926 ed Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 a Marco Conti. Enrico M. Daldello è stato sostenuto da una borsa di studio della Fondazione Lalor e Natasja G. J. Costermans è stata sostenuta da una borsa di studio Rubicon dell’Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO).
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
Referenzen
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