تحديد برنامج ترجمة مرنا الأم أثناء النضوج في المختبر باستخدام اختبار مراسل Oocyte واحد
Summary
يصف هذا البروتوكول مقاهات المراسل لدراسة تنظيم ترجمة الحمض النووي الريبي في البويضات المفردة أثناء النضج في المختبر.
Abstract
وقد وصفت جيدا الأحداث المرتبطة النضج النووي البويضات. ومع ذلك ، لا يعرف الكثير عن المسارات والعمليات الجزيئية التي تحدث في السيتوبلازم استعدادا للإخصاب واكتساب التوبيتوتين. أثناء نضوج البويضات، تعتمد التغيرات في التعبير الجيني حصريا على ترجمة وتدهور الحمض النووي الريبي الرسولي الأمومي (mRNAs) بدلا من النسخ. وبالتالي، يلعب تنفيذ البرنامج الترجمي دورا رئيسيا في تأسيس كفاءة نمو البويضات للحفاظ على نمو الجنين. هذه الورقة هي جزء من التركيز على تحديد برنامج ترجمة الحمض النووي الريبي الأمومي الذي يحدث أثناء النضج المتوسط وفي الانتقال من البويضات إلى الزيجوتي. في ورقة الأسلوب هذه، يتم تقديم استراتيجية لدراسة تنظيم ترجمة الحمض النووي الريبي المستهدف أثناء نضوج البويضات في المختبر. هنا، يتم دمج مراسل Ypet إلى المنطقة 3 ‘غير المترجمة (UTR) من جين الفائدة ومن ثم حقنها في البويضات جنبا إلى جنب مع ترميز ميرنا متعددة الأضلاع ل mCherry للسيطرة على حجم حقن. باستخدام المجهر الفاصل زمنيا لقياس تراكم المراسل، يتم حساب معدلات الترجمة في انتقالات مختلفة أثناء النضج الدموي البويضات. هنا، تم وصف بروتوكولات عزل البويضات وحقنها، وتسجيل الفاصل الزمني، وتحليل البيانات، وذلك باستخدام مراسل Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3’UTR كمثال.
Introduction
تخضع البويضات الثديية الكاملة النمو لتغيرات سريعة استعدادا للإخصاب واكتساب التريبوتين. وهذه التغيرات ضرورية للحفاظ على النمو الجنيني بعد الإخصاب. على الرغم من أن الأحداث المرتبطة بالنضج النووي موصوفة بشكل جيد نسبيا ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن العمليات والمسارات الجزيئية في السيتوبلازم البويضات. خلال المراحل النهائية من نضوج البويضات ، تكون البويضات صامتة نسخيا ، ويعتمد التعبير الجيني اعتمادا كليا على ترجمة ميرناوتدهورها 1،2. تركيب البروتينات الحاسمة للكفاءة التنموية، لذلك، يعتمد على برنامج الترجمة في الوقت المناسب من الحمض النووي الريبي طويلة الأجل التي تم توليفها في وقت سابق خلال نمو البويضات1،3. كجزء من التركيز على تعريف هذا البرنامج من ترجمة مرنا الأم المنفذة خلال النضج المطيسي وفي الانتقال البويضات إلى الزيجوتي، تقدم هذه الورقة استراتيجية لدراسة تفعيل وقمع ترجمة الحمض النووي الريبي الأم المستهدفة في البويضات واحدة أثناء النضج المتوسطي في المختبر.
في هذه الطريقة، يتم استنساخ إطار القراءة المفتوحة YPet المنبع من UTR 3 ‘من نص الاهتمام. بعد ذلك، يتم حقن mRNAs ترميز هذا المراسل في البويضات جنبا إلى جنب مع mRNAs متعددة الأضلاع ترميز mCherry للسيطرة على حجم حقن. يتم قياس تراكم المراسل أثناء النضج الدموي في المختبر باستخدام المجهر الفاصل الزمني. يتم تسجيل تراكم البروتين الفلوري الأصفر (YFP) و mCherry في البويضات الفردية ، ويتم تصحيح إشارات YFP من خلال المستوى الهضب للمشيري المحقون. بعد الحصول على البيانات، يتم حساب معدلات الترجمة لفواصل زمنية مختلفة أثناء النضج الدموي في المختبر عن طريق حساب منحدر المنحنى الذي تم الحصول عليه عن طريق تركيب المنحنى.
ويوفر هذا النهج أداة للتأكد تجريبيا من التغيرات في ترجمة الرنانات الذاتية المختارة. وبالإضافة إلى ذلك، يسهل هذا الأسلوب توصيف العناصر التنظيمية التي تتحكم في الترجمة أثناء النضج البويضي من خلال التلاعب بالعناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة من 3′ UTR من mRNAs الهدف4،5،6. التلاعب في طول ذيل بولي (A) يسمح أيضا نظرة ثاقبة النشاط adenylase / deadenylase في البويضات5. يمكن استخدام موتاجينيسيس من عناصر رابطة الدول المستقلة بالنيابة أو RNA المناعي لدراسة التفاعلات مع cognate الحمض النووي الريبي ملزمة البروتينات6،7. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المكونات الأساسية لبرنامج الترجمة التي تعتبر حاسمة لكفاءة نمو البويضات من خلال قياس الهدف 3′ ترجمة UTR في النماذج المرتبطة بانخفاض جودة البويضات 8و9و10. تقدم ورقة الأسلوب هذه تجربة تمثيلية حيث تم حقن البويضات الناضحة لفئران C57/BL6 البالغة من العمر 21 يوما بالحقن الدقيق مع مراسل Ypet المنصهر في UTR 3 من IL-7. وقد وصفت الإعداد والبروتوكول لحقن البويضات، وتسجيل الفاصل الزمني، وتحليل البيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف الطريقة المقدمة استراتيجية لدراسة تنشيط وقمع ترجمة الحمض النووي الريبي المستهدف في التحولات المختلفة أثناء النضج الدموي في المختبر. IL-7، تم اختيار السيتوكين الصادر عن البويضات التي قد تشارك في الاتصالات الخلية البويضات-الركامية8،13،لغرض وصف هذه ا?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 GM097165، GM116926 ومراكز يونيس كينيدي شرايفر NICHD الوطنية للبحوث التحويلية في الإنجاب والعقم P50 HD055764 لماركو كونتي. 10- وتحظى إنريكو م. دالديلو بدعم من زمالة من مؤسسة لالور، وتحظى ناتاسيا ج. ج. كوسترمانز بدعم من زمالة روبيكون من المنظمة الهولندية للبحث العلمي.
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
Referenzen
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
- Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3’UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3′ UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3′ uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
