렙토메뇌질환의 직접 표적 치료를 연구하는 뮤린 옴마야 제노이식 모델

프로토콜은 사우스 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IS00005974)에 의해 승인되었다. 1. 마우스 LMD 모델을 생성하기 위해 CF에 CtC를 주입 CtC 준비 주입에 필요한 CtC수를 계산하고, 멸균 인산염 완충식식염(PBS)에서 1.0 × 104 세포/μL에서 단일 셀 서스펜션을 준비한다. 세포 현탁액을 얼음 에 놓거나 시술 내내 4 °C로 놓습니다.참고: 트립시니화를 필요로 하는 세포주를 사용하는 경우, 살균 PBS로 세포를 두 번 세척하여 트립신을 제거하십시오. 혈전계 또는 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 수행합니다. 큰 코호트 (>50 마우스)가 사용되는 경우, 세포를 재검표하고 세포의 일관된 수를 보장하기 위해 주사 사이의 세포 생존가능성을 검증 마우스 당 투여. 외과 전 수술 1 mg/kg buprenorphine 지속 방출 (Bup-SR)로 마우스를 피하로 주입하십시오.참고: 제안된 절개 영역을 주입하지 마십시오. 사포에서 멀리 떨어진 주사 부위를 선택하십시오. 마우스를 2-3%로 마취하여 오른쪽 반사의 징후가 보이지 않을 때까지 이소플루란으로 마취합니다. 또한, 마취 상태를 확인하기 위해 꼬리 및/ 또는 발 핀치 반사를 확인하십시오. 수술 영역에서 멀리 떨어진 위치에서 수술을 위해 마우스를 준비합니다. 외과 부위(즉, 두개골의 등쪽 표면)를 절개 부위를 오염시키는 데 모피를 유지하기에 충분한 국경 영역을 가진 클립; 그런 다음, 발거 피부 방부제로 사이트를 포화시키고, 부지 의 중심에서 주변까지 작업한 다음 건조할 수 있습니다. 멸균 드레이프 또는 멸균 접착제 지원 플라스틱 커튼 소재를 적용하여 수술 부위를 오염으로부터 보호합니다.참고: 악기는 사전에 자동 으로 사용되어야 하며 유리 비드 멸균기를 사용하여 동물 간에 다시 멸균된 팁이 있습니다. 머리의 전체 복부 표면의 털을 면도하고 멸균 기술을 사용하여 피부를 준비합니다. 스테레오전술 장치의 수정된 L자형 코 콘으로 코를 배치하여, nares가 명확하고 개방된 상태를 유지하도록 합니다. 두 피네의 복부 표면에 테이프를 사용하여 피부를 부드럽게 당겨 코 콘에 고정하고 한 번 고정되면 약 90 ° 각도로 목을 구부립니다. 마취를 유지하기 위해 1.5 %의 이소플루란을 투여하십시오.참고: 적절한 위치 지정으로 인해 절개 부위가 표시되어 후두 뼈의 코달 능선을 쉽게 식별할 수 있습니다. 척추가 시스테나 마그나와 함께 수평을 유지하고 꼬리에 약간의 견인력을 바르면서 꼬리 베이스에 테이프를 놓아 고정하십시오. 외과 시스테나 마그나 주사 목이 완전히 확장되고 피네 사이를 시작하면 외과 가위 팁을 후두 뼈를 가로 질러 약간의 압력으로 아래쪽으로 실행하십시오.참고 : 이 중간 위치에있는 동안, 가위 팁은 시스테나 마그나 (cisterna magna)를 통해 오목한 지역에 담그면 작은 우울증이 눈에 띈다. 만지작한 굴착성 바로 위에 작은 3-5mm 미드라인 절개를 만듭니다. 셀 서스펜션5μL을 1.0× 10 4세포/μL(총 5.0× 104세포)에서 30G 해밀턴 주사기로 그립니다. 1-2mm 팁이 있는 무딘 팁의 퍼프를 사용하여 시스테나 마그나를 부드럽게 누릅니다. 닫힌 위치에 팁을 소개하고 듀라에 하향 압력을 가하면서 열어 보십시오. 반복 무딘 해부는 dural 막이 쉽게 식별 될 때까지 이전 단계에서 설명, 관련 혈관은 노출 된 지역에서 볼 수 있습니다.참고: 결과 주입 창은 바늘 삽입 도중 혈관이 손상되지 않았는지 확인합니다. 주변 근육을 후퇴시키기 위해 포셉을 열어 두면서, 듀라 아래에 30 G 비 코링 바늘을 도입하여 경사를 시각화합니다. 바늘이 벨 자체를 넘어서만 도입되도록 하십시오. 주사기 플런저를 천천히 배치하고 듀라 바로 아래에 셀을 전달합니다. 제대로 듀라 아래에 주사를 관찰하는 bevel을 배치합니다. 신중하게 기술을 관리하고, 멤브레인의 손상을 방지하고 최소한의 누출을 보장하기 위해 30 G 비 코링 바늘을 사용합니다. 누출이 지적되면 면기울어로 부드러운 압력을 가하십시오. 상처 클립이나 피부 접착제의 마이크로 드롭을 적용하여 피부를 닫습니다. 주사가 성공적으로 수행되면 마우스가 따뜻한 담요에 마취에서 회복하여 흉골 위치를 유지하고 의도적 인 움직임을 입증 할 때까지 지속적으로 관찰하십시오. 첫 주 동안 수술 후 매일 마우스를 모니터링하십시오. 마우스가 통증이나 고통에 있는 것처럼 보이는 경우에, 수의 상담 및 지시에 따라 5 일 동안 12 에서 24 시간마다 한 번 10 mg/kg 피하 주사로 취급하십시오. 마우스가 다음 단계로 진행하기 전에 적어도 48 에서 72 시간 동안 그들을 복구하고 모니터링 할 수 있습니다.참고: Bup-SR은 선제적으로 제공되므로 최대 72시간까지 지속되므로 추가 진통제가 필요하지 않습니다. 그러나 동물은 필요에 따라 추가 진통을 제공합니다 (무기력한 경우, 먹지 않는, 주름이 있습니다). 수술 부위가 수술 후 감염의 징후를 개발하는 경우 (즉, 발적, 붓기, 부드러움, 알로디니아, 과민증, hyperpathia, 또는 suppuration), 또는 마우스가 영향을받는 영역을 지키고있는 경우, 마우스를 안락사. 암세포가 CSF에 성공적으로 주입되는 경우, LMD 및 종양 진행은 1 또는 2 주 이내에 CNS에서 개발될 것입니다 (사용되는 CTC 또는 세포주 유형에 따라 다름)(그림 1). 2. 뮤린 옴마야 조립 및 이식 역 의 준비 스테이션 표면을 소독합니다. 표면에 파란색 덮개를 놓고 그림 2에표시된 모든 멸균 도구 및 소모품을 준비하십시오. 외과 전 수술 진통(Bup-SR)을 적용하고, 1.2항에 설명된 바와 같이 멸균 기술을 유지한다. 뮤린 옴마야의 외과 이식 25G(외경 0.51mm) 소형 사출포트와 1mm 스페이서 디스크를 사용하여 뮤린 옴마야 분사 장치를 조립한다. 시아노아크라이레이트 멸균 접착제를 사용하여 금속 캐뉼라약 2.5mm의 오른쪽 대뇌 반구(그림3A-C)의침투를 보장한다.참고: MRI 호환 마우스 옴마야 프로토타입은 이미 두 부품(소형 사출 포트 및 스페이서) 3D를 단일장치(그림 3D)로함께 인쇄한 실험실에서 개발되었습니다. 단일 단위 버전은 MRI에 의해 테스트되었으며 어셈블리 단계를 제거하여 시간을 절약할 수 있습니다. 오른쪽 반사의 흔적이 없을 때까지 2-3 %의 이소플루란으로 마우스를 마취시합니다. 또한, 마취 상태를 확인하기 위해 꼬리 및/ 또는 발 핀치 반사를 확인하십시오. 앞서 설명한 바와 같이 모피 의 머리의 전체 복부 표면을 면도하고, 멸균 기술에 따라 피부를 준비한다 1.2.3. 절차 중에 이소플루란 투여를 계속하기 위해 코 콘을 가진 스테레오전술 장치에 마우스를 놓는다; 이소플루란을 1.5%로 줄입니다. 이어바를 부드럽게 조이면 머리를 고정하고 눈 윤활유를 발라 마우스의 눈을 가룹니다. 작은 피부 절개 (3mm)를 만들고, 두개골을 드러내기 위해 기본 피하 조직의 무딘 해부를 만듭니다. 과산화수소에 담근 면 팁 어플리케이터 스틱을 사용하여 두개골을 건조시십시오. 두개골 0.5mm 후방 및 1.1mm 의 두개골 에 버 구멍을 뚫고 두개골의 해부학적 점(관상 봉합사가 처상 봉합사(도 3A)에 의해 수직으로 교차되는 두개골의 해부학적점(도 3A)뿐만아니라 0.9mm 버 구멍이 두라 메이트어를 노출한다. 마이크로드릴을 옆으로 이동시키고, 시아노아크라이레이트 멸균 접착제를 사용하여 두개골에 부착된 사출 포트(약 2.5mm 깊이)를 삽입하기 전에 버 구멍을 둘러싼 뼈를 부드럽게 점수매로 한다. 중단 된 스티치 패턴 또는 지갑 문자열 봉합사(11)에4-0 흡수성 나일론 봉합사를 사용하여 사출 지점 주위에 주 봉합사. 수술 후 마우스는 수술 회복을 위한 개별 케이지에 있습니다.참고: Murine Ommaya는 여러 수술 회수 마우스가 동일한 케이지에 보관될 때, 아마도 지속적인 변조 상호 작용으로 인해 벗겨질 수 있습니다. Murine Ommaya 이식 된 마우스는 약물 효능 시험 의 과정을 통해 개별적으로 보관 (또는 케이지 당 2 마우스 이상) 수용 하는 것이 좋습니다. 3. 뮤린 옴마야 치료 뮤린 옴마야를 사용하여 마우스를 주입 오른쪽 반사의 흔적이 없을 때까지 2-3 %의 이소플루란으로 마우스를 마취시합니다. 또한, 마취의 유지 보수를 확인하기 위해 꼬리 및 / 또는 발 핀치 반사를 확인합니다. 포트 사출 어댑터와 해밀턴 주사기를 사용하여 Murine Ommaya에 액세스 할 수 있습니다. 집게를 사용하여 소형 사출 포트의 상단을 잡고 포트 인젝터 어댑터를 포트의 중격에 부드럽게 삽입합니다.참고: 포트 인젝터는 죽은 공간을 최소한으로 줄이고 전동 주사기펌프(그림 4A)를통해 제어된 주입을 허용하는 방식으로 포트의 중격을 관통합니다. 표적/신규 치료는 마취 하에 있는 동안 1 μL/min의 유량으로 주입됩니다. 처리는 연구원의 재량에 따라, 정해진 기간 (주/달)에 대한 지정된 간격 (매일 / 주)에서 주어집니다.3μL 사이의 부피는 3 μL 너무 많은 압력을 일으킬 수 있기 때문에 최적입니다. 해밀턴 주사기의 크기는 각 치료 암의 마우스 수에 따라 10에서 100 μL까지 다양할 수 있습니다. 적절한 볼륨을 해밀턴 주사기에 미리 로드하면 주사기의 반복교체가 방지되어 오류를 최소화할 수 있습니다. 치료 팔 당 해밀턴 주사기 1개도 헌납하는 것이 가장 좋습니다. 주사가 이루어지면, 포셉을 사용하여 포트 주입 어댑터에서 Murine Ommaya를 분리하고, 1.3.7 단계에서 전술한 바와 같이 마취로부터 회복하기 위해 마우스를 케이지로 돌려놓는다. 안락사 압축 탱크 소스로부터이산화탄소(CO2)를흡입하여 마우스를 안락사시다. 마우스를CO2의 농도 증가에 노출시(즉, 챔버 부피/분의 10%에서 30%까지의 변위율이 사용됩니다)을 피하거나 불편함이나 고통을 최소화한다. 심혈관 및 호흡 운동의 중단이 보장될 때까지 마우스를 모니터링합니다.