Geração e montagem de nucleocapsídeos específicos do vírus do vírus sincicial respiratório

Os vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) incluem muitos patógenos humanos significativos, como raiva, Ebola e vírus sincicial respiratório (RSV)^1,2. O RSV é a principal causa de doenças respiratórias, como bronquiolite e pneumonia em crianças pequenas e idosos em todo o mundo³. Atualmente, não há vacinas efetivas ou terapias antivirais disponíveis para prevenir ou tratar o RSV⁴. Como parte do ciclo de vida, o genoma RSV serve como modelo para replicação pela polimerase RNA dependente do RSV RNA para produzir um antígeno, que por sua vez atua como modelo para gerar um genoma descendente. Tanto o genoma quanto o antígeno RNAs são inteiramente encapsidados pela nucleoproteína (N) para formar os nucleocapsídeos (NCs)³. Como os NCs servem como modelos para replicação e transcrição pela polimerase RSV, o conjunto NC adequado é crucial para que a polimerase tenha acesso aos modelos para síntese de RNA⁵. Curiosamente, com base nas análises estruturais das polmerases virais NNS, hipótese-se que várias proteínas N se dissociam transitoriamente das NCs para permitir o acesso da polimerase e rebinadas ao RNA após a síntese do RNA^{6,7,8,9,10,11,12}.

Atualmente, o ensaio de polimerização RSV RNA foi estabelecido utilizando polimerase RSV purificada em modelos de RNA nus curtos^13,14. No entanto, as atividades da polimerase RSV não alcançam o ideal, como observado nos produtos não processivos e abortivos gerados pela polimerase RSV ao usar modelos de RNA nus. A falta de NC com RNA específico do vírus é uma barreira primária para a compreensão mecanicista da síntese do RSV RNA. Portanto, o uso de um modelo de RNA autêntico torna-se uma necessidade crítica para avançar no conhecimento fundamental da síntese de RNA RSV. As estruturas conhecidas das partículas semelhantes a nucleocapsídeos (NCLPs) do RSV e de outros vírus NNS RNA revelam que os RNAs nos NCLPs são RNAs celulares aleatórios ou RNAs genômicas virais^{médias 15,16,17,18,19}. Juntos, o principal obstáculo é que N liga não especificamente aos RNAs celulares para formar NCLPs quando n é superexpresso nas células host.

Para superar esse obstáculo, estabelecemos um protocolo para obter o RNA sem RNA (N⁰) primeiro e montar o N⁰ com RNA genômico viral autêntico em NCLPs²⁰. O princípio deste protocolo é obter uma grande quantidade de N (N) recombinante livre de RNA (N⁰⁾co-expressando N com um acompanhante, o domínio n-terminal de fosfoproteína RSV (P_NTD). O N⁰P purificado poderia ser estimulado e montado em NCLPs adicionando oligos RNA específicos do RSV, e durante o processo de montagem, o acompanhante P_NTD é deslocado após a adição de oligos RNA.

Aqui, detalhamos um protocolo para a geração e montagem de NCs específicos do RSV RNA. Neste protocolo, descrevemos a clonagem molecular, preparação de proteínas, montagem in vitro e validação da montagem complexa. Destacamos a estratégia de clonagem para gerar construções bi-cistrônicas para coexpressão de proteínas para clonagem molecular. Para a preparação de proteínas, descrevemos os procedimentos da cultura celular, extração de proteínas e a purificação do complexo proteico. Em seguida, discutimos o método de montagem in vitro dos NCs específicos do RSV RNA. Finalmente, usamos cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e microscopia eletrônica de manchas negativas (EM) para caracterizar e visualizar os NCLPs montados.