Aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides

Todos los experimentos con animales se realizaron bajo la licencia ZH152/17 de acuerdo con las normas y reglamentos de la Comisión Cantonal de Ética de Zúrich y la instalación animal EPIC en el Instituto de Ciencias de la Salud Molecular, ETH Zurich. NOTA: Este protocolo comienza con la eliminación de los H19- y IG-DMR en los phaESC. Para obtener más información sobre cómo establecer líneas phaESC, consulte los informes publicados10,13. En la Figura 1A se proporciona una visión general y un marco temporal de este protocolo (pasos 1–14); medios, soluciones y búferes se enumeran en la Tabla 1. El procedimiento para establecer líneas DKO-phaESC (pasos 1–6) se muestra en la Figura 1B,y la estrategia para la construcción de embriones semi-clonados (pasos 7–14) se representa en la Figura 1C. 1. Transfección de plásmidos para la eliminación de H19-DMR e IG-DMR en fases Prepare plásmidos CRISPR/Cas9 para la coexpresión de las nucleases Cas9 y guíe a los ANR para dirigirse a las eliminaciones de H19-DMR e IG-DMR. Ligar cuatro pares de oligos de ARN guía (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R enumerada en la Tabla 2) en plásmidos pX330.NOTA: Consulte el protocolo publicado sobre el procedimiento detallado para la preparación de estos 4 plásmidos CRISPR/Cas914. Alternativamente, los plásmidos disponibles para cepas generales de ratón también son accesibles a través de un repositorio (Tabla de Materiales). Cubra la superficie de un pozo de una placa de 6 pozos con 1 ml de solución de gelatina al 0,2% mediante incubación a 37 °C durante 10 minutos. Placa 2 × 105 fasfas de tipo salvaje en el pozo recubierto de gelatina en medio haESC sin antibióticos, e incubar la placa a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5% durante 1 día.NOTA: Los antibióticos se omiten del medio para aumentar la eficiencia de la lipofección posterior. Usamos fasfas de tipo salvaje en el paso 10. Recomendamos utilizar fases de paso temprano, pero se ha utilizado con éxito una variedad de números de pasaje8. Actualmente se desconoce la correlación entre el número de pasaje y la eficiencia de la obtención de embriones y ratones semi-clonados. Fases de transfectos en el pozo de una placa de 6 pozos (desde el paso 1.3) con 6 plásmidos simultáneamente utilizando reactivo de lipofección: plásmido piggyBac de 50 ng que transporta un transgénero CAG-EGFP, Plásmido transposasa 50 ng piggyBac y 600 ng de cada uno de los 4 plásmidos CRISPR/Cas9 (del paso 1.1). Consulte el protocolo del fabricante sobre el procedimiento detallado de la transfección.NOTA: Dos plásmidos piggyBac se utilizan para integrar un transposon para la expresión omnipresente de proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en el genoma de los phaESC. Si no se requiere el marcado GFP de las células, estos dos plásmidos pueden ser sustituidos por un plásmido CRISPR/Cas9 para la expresión transitoria de proteínas de fluorescencia (por ejemplo, plásmido pX458) en lugar de uno de los plásmidos pX330. La expresión EGFP transitoria se puede utilizar para ordenar celdas transfectadas. Dos días después de la transfección, aspirar el medio, y añadir 800 μL de trippsina. Incubar la placa a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5% durante 5 minutos. A continuación, agregue 2 ml de búfer de lavado para apagar la trypsin y pipetear varias veces para obtener una sola suspensión celular. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrífuga el tubo a 160 x g durante 5 minutos, y retire el sobrenadante. Resuspend el pellet celular en 400 μL de búfer de mantenimiento haESC complementado con 15 μg/mL Hoechst 33342.NOTA: Para reducir la toxicidad potencial de Hoechst 33342, se han utilizado 1 μg/mL Hoechst 33342 y 50 μM verapamil en lugar de 15 μg/mL Hoechst 3334215. Incubar la suspensión celular a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5% durante 15 min. Después de la incubación, transfiera la suspensión celular a un tubo de 5 ml a través de una tapa del colador celular y mantenga el tubo a 4 °C hasta que esté listo para usarse en el siguiente paso (sección 2). 2. Chapado de una sola célula de fases transfectadas utilizando un citómetro de flujo Un día antes de ordenar los falosescos transfectados, placa irradiado fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en placas de 96 pozos recubiertas de gelatina a una densidad de 4 × 104 células/cm2 en medio MEF. Normalmente, 6 placas están preparadas para establecer una línea phaESC con eliminaciones específicas. Incubar las placas a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%.NOTA: Los MEF irradiados están disponibles comercialmente. Utilizamos MEF derivados de embriones E12.5 de ratones DR4. Aunque los haESC pueden crecer en placas recubiertas de gelatina sin MEF, recomendamos mefs para aumentar la viabilidad de los haESC individuales ordenados. El día de la clasificación, aspirar el medio MEF de las placas de 96 pozos, y añadir 120 μL de haESC fresco medio por pozo. Mantenga las placas a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Configure una clasificador de celdas con una boquilla de 100 μm de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un láser UV de 355 nm y un láser azul de 488 nm se utilizan para la excitación de hoechst 33342 y fluorescencia EGFP, respectivamente.NOTA: Alternativamente, Hoechst 33342 se puede detectar por excitación con 405 nm. Ordene las fases transfectadas en el tubo de 5 ml (desde el paso 1.10) utilizando una puerta para recoger células haploides en la fase G1/S que muestran la expresión EGFP. Deposite una sola celda en cada pozo de las placas de 96 pozos desde el paso 2.2.NOTA: La detección de la tinción de Hoechst 33342 generalmente distingue 3 picos de células con un contenido de ADN de 1n, 2n y 4n, que corresponden a células haploides en fase G1, una mezcla de células haploides en células de fase G2/M y diploides en fase G1, y células diploides en fase G2/M, respectivamente. Las células haploides en fase G1/S se identifican como el pico con menor intensidad de fluorescencia Hoechst 33342. Un resultado representativo y una puerta de ordenación se muestran en la figura 2A. Después del chapado, incuba las placas de 96 pozos a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5%. 3. Subagulación de fases transfectadas Tres días después del chapado de una sola célula, las colonias se pueden observar en varios pozos de las placas de 96 pozos bajo un microscopio. Marca los pozos en los que sólo crecen las colonias individuales.NOTA: En nuestra experiencia, se observaron colonias individuales en el 20%-40% de los pozos de las placas de 96 pozos. El día 4 después del chapado unicelular, reemplace la mitad del medio por un nuevo medio haESC en los pozos por colonias individuales. Un día antes de pasar (en el día 4 o 5 después del chapado de una sola célula), placa irradiada MEF en placas de 96 pozos recubiertas de gelatina a una densidad de 4 × 104 celdas/cm2 en medio MEF. Mantenga las placas a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Después de 5 o 6 días de chapado de una sola célula, seleccione los pozos de las placas de 96 pozos que contienen colonias individuales con un diámetro superior a 150 μm.NOTA: Se seleccionan aproximadamente 100 pozos preferiblemente para establecer una línea phaESC con las eliminaciones dmr específicas. Aspirar el medio en los pozos seleccionados y añadir 30 μL de trippsina. Incubar las placas de 96 pozos a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5% durante 5 minutos. A continuación, agregue 30 μL de tampón de lavado a cada pozo para apagar la trypsina. Agregue 140 μL de medio haESC en cada pozo, y pipeta varias veces para obtener células individuales. Aspirar el medio MEF de los pozos de las placas de 96 pozos preparadas en el paso 3.3. Transfiera las fases de cada pozo desde el paso 3.6 a un pozo fresco de la nueva placa de 96 pozos desde el paso 3.7. Incubar las placas de 96 pozos que contienen subclones phaESC a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Al día siguiente, aspirar todo el medio de cada pozo, y añadir 120 μL de nuevo medio haESC. Incubar las placas a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Un día antes de que las células se vuelvan confluentes para pasar, platee los MEF irradiados en placas de 24 pozos recubiertas de gelatina a una densidad de 4 × 104 células/cm2 en medio MEF. Mantenga las placas a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Cuando los phaESC se hayan vuelto confluentes para el passaging, aspirar el medio y añadir 30 μL de trippsina. Incubar las placas de 96 pozos a 37 °C durante 5 minutos. Agregue 90 μL de búfer de lavado en cada pozo para apagar la trypsina. Pipeta varias veces para obtener células individuales. Aspirar el medio MEF de los pozos de las placas de 24 pozos desde el paso 3.11, y añadir 600 μL de haESC fresco medio. Transfiera 60 μL de la suspensión de subclones phaESC de cada pozo en el paso 3.13 a un nuevo pozo de las placas de 24 pozos desde el paso 3.14. Mantenga la suspensión restante de cada subclone phaESC para la extracción de ADN y genotipado en el paso 4. Incubar las placas de 24 pozos con las subclones phaESC a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Un día antes de que los cultivos celulares alcancen la densidad para pasar, platee los MEF irradiados en placas de 6 pozos recubiertas de gelatina a una densidad de 4 × 104 células/cm2 en medio MEF. Mantenga las placas a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Cuando los phaESC se vuelvan lo suficientemente confluentes para el passaging, aspirar el medio y añadir 250 μL de trippsina. Incubar las placas de 24 pozos a 37 °C durante 5 minutos.NOTA: Después del genotipado en el paso 4.9, solamente las líneas phaESC con las eliminaciones del H19-DMR y el IG-DMR necesitan ser pasadas. Agregue 750 μL de tampón de lavado en cada pozo para saciar la trypsina. Pipeta varias veces para obtener una sola suspensión celular. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrífuga el tubo a 160 x g durante 5 minutos, retire el sobrenadante y resuspend el pellet celular en 2 ml de medio haESC. Aspirar el medio MEF desde los pozos de las placas de 6 pozos desde el paso 3.17. Transfiera la suspensión phaESC de cada tubo del paso 3.20 a un nuevo pozo. Mantenga las placas a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Expanda los clones celulares repitiendo los pasos 3.17 a 3.21 y aumentando el tamaño de la placa y los volúmenes de trypsin, buffer de lavado y medio haESC. Prepare un matraz T25 para cada línea phaESC sub-clonada de MEF para el paso 5.NOTA: Recomendamos congelar una coartada de cada línea phaESC sub-clonada en 300 μL de medio de congelación y mantener un criostock en el almacenamiento de nitrógeno líquido antes de proceder al paso 5. 4. Primer genotipado de líneas phaESC sub-clonadas con MEF Para extraer ADN genómico de la suspensión celular restante del paso 3.15, agregue 200 μL de tampón de lisis a cada pozo de las placas de 96 pozos. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Enjuague cada pozo con 200 μL adicionales de tampón de lisis para recuperar todas las células restantes y recoger en el mismo tubo de 1,5 ml. Incubar el tubo de 1,5 ml a 55 °C durante 3 h con mezcla. Después de la incubación, añadir 460 μL de isopropanol a cada tubo de 1,5 ml, y mezclar suavemente hasta que un precipitado de ADN se haga visible. Centrífuga los tubos a ≥ 10.000 x g durante 5 minutos y retire el sobrenadante. Lave los pellets de ADN con 200 μL de etanol al 70%. Centrífuga los tubos a ≥ 10.000 x g durante 5 minutos y retire el sobrenadante. Seque los tubos en aire durante 10 minutos y luego resuspend el ADN en 20 μL de agua. Realice la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la polimerasa de ADN termoestable siguiendo el protocolo del fabricante.NOTA: Los pares de imprimación para PCR se enumeran en la Tabla 2 y se utilizan de la siguiente manera: H19-DMR-P1 y P3 (407 bp para H19-DMR eliminado); H19-DMR-P2 y P3 (623 bp para wildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 y P3 (319 bp para IG-DMR eliminado); IG-DMR-P2 y P3 (492 bp para wildtype IG-DMR). El perfil de temperatura de PCR para todos los pares de imprimación es el siguiente: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. La longitud de los fragmentos de ADN amplificados para las eliminaciones H19-DMR e IG-DMR muestra cierta variación debido a la unión final no homóloga asociada con la edición mediada por CRISPR/Cas9. Los FADC fueron cultivados con MEF, que contienen el wildtype H19-DMR y IG-DMR DNA. Por lo tanto, los pares de imprimación de H19-DMR-P2/P3 e IG-DMR-P2/P3, que amplifican fragmentos de ADN de tipo salvaje, no son informativos. Sin embargo, estos pares de imprimación se incluyen como controles y deben dar una banda en todas las reacciones. Analice los fragmentos de PCR mediante electroforesis de gel de agarose. Consulte el protocolo publicado sobre el procedimiento detallado de la electroforesis16. Identifique las líneas celulares con las eliminaciones de H19-DMR y IG-DMR. Una imagen representativa de la electroforesis se muestra en la Figura 2B.NOTA: En nuestro caso, se identificaron ocho líneas celulares con eliminaciones de H19-DMR e IG-DMR entre 135 líneas phaESC sub-clonadas. 5. Purificación celular haploide de líneas phaESC sub-clonadas Cuando los cultivos phaESC sub-clonados en los matraces T25 del paso 3.22 se vuelven lo suficientemente densos como para pasar, aspirar el medio y añadir 1,5 ml de trypsin. Incubar el matraz a 37 °C durante 5 min. A continuación, agregue 4,5 ml de tampón de lavado y pipeta varias veces para obtener una suspensión de una sola celda. Transfiera cada suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrífuga el tubo a 160 x g durante 5 minutos. Retire el sobrenadante y resuspend los pellets celulares en 400 μL de búfer de mantenimiento haESC complementado con 15 μg/mL Hoechst 33342. Incubar las suspensiones celulares a 37 °C durante 15 min. Después de la incubación, transfiera las suspensiones celulares a un tubo de 5 ml a través de una tapa de colador celular. Enjuague la tapa del colador celular con 400 μL adicionales de búfer de mantenimiento haESC y recoja las células restantes en el mismo tubo de 5 ml. Mantenga el tubo a 4 °C hasta que esté listo para ordenarse. Configure un cytómetro de flujo con una boquilla de 100 μm de acuerdo con las instrucciones del fabricante.NOTA: Hoechst 33342 se puede detectar por excitación a 405 nm. Aquí, se utiliza un láser UV de 355 nm para la detección de Hoechst 33342. Configure la suspensión celular (desde el paso 5.3) y un nuevo tubo de 15 ml que contenga 2 ml de búfer de mantenimiento haESC para recoger células ordenadas en el cytómetro de flujo. Inicie el análisis y configure la puerta de clasificación para recoger celdas haploides en la fase G1/S. Refiera al histograma en la Figura 2A para identificar la población de fase G1/S phaESC.NOTA: Algunas líneas phaESC sub-clonadas pueden no contener ninguna celda haploide debido a la diploidización completa o el a cuadro erróneo de células diploides en el paso 2. Si no se observan células haploides en la fase G1/S, proceda a otra muestra sin ordenar. En nuestro caso, 5 líneas celulares contenían células haploides y 3 líneas celulares contenían solo células diploides de 8 líneas phaESC sub-clonadas. Después de la clasificación celular, agregue 5 ml de búfer de lavado a lo largo de la pared del tubo de recolección de 15 ml. Centrífuga el tubo a 160 x g durante 5 minutos. Retire el sobrenadante. Seleccione una placa de tamaño adecuado para la culturing dependiendo del número de celdas ordenadas. Utilice un solo pozo de una placa de 96 pozos, una placa de 24 pozos y una placa de 12 pozos para cultivo de 1.000-40.000 células, 40.000-200.000 células y 200.000-400.000 células, respectivamente. Resuspend el pellet celular en 120 μL, 600 μL y 1,2 ml de haESC medio, respectivamente.NOTA: Platee las células a alta densidad porque la baja confluencia puede causar la muerte celular de las células después de la clasificación. A partir de este momento, los phaESC se cultivan en pozos recubiertos de gelatina sin MEF para facilitar el genotipado en el paso 6 y la posterior aplicación de inyección intracitoplasmática a partir del paso 9. Después de transferir la suspensión celular a un pozo recubierto de gelatina del tamaño adecuado, incubar la placa a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Continúe expandiendo los cultivos phaESC repitiendo los pasos 3.18 a 3.21 con el aumento de los tamaños de placa y el aumento de los volúmenes de trypsina, tampón de lavado y medio haESC. Las células se cultivan en pozos recubiertos de gelatina sin MEF. Para cada línea phaESC sub-clonada, prepare una cultura en un pozo de una placa de 24 pozos y un pozo de una placa de 6 pozos para los pasos 6 y 9, respectivamente.NOTA: Algunas células de cada línea phaESC sub-clonada deben congelarse en 300 μL de medio de congelación como criostock en un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido antes de proceder al paso 9. 6. Segundo genotipado de líneas phaESC sub-clonadas sin MEF NOTA: Se realiza una segunda ronda de genotipado para confirmar que las líneas phaESC sub-clonadas poseen eliminaciones de los DMR H19- e IG- , y que los alelos de wildtype están ausentes después de la eliminación de los MEF. Confirme bajo el microscopio que los cultivos en pozos de las placas de 24 pozos del paso 5.11 están libres de MEF.NOTA: Si se observan MEF, es necesario seguir pasando las culturas hasta que los MEF hayan desaparecido para evitar contaminar el PCR con ADN de tipo salvaje de los MEF. Aspirar el medio de cultivos confluentes y añadir 400 μL de tampón de lisis por pozo de la placa de 24 pozos. Después de pipetear varias veces, transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Incubar el tubo de 1,5 ml a 55 °C durante 3 h con mezcla. Después de la incubación, añadir 400 μL de isopropanol al tubo de 1,5 ml, y mezclar suavemente hasta que un precipitado de ADN se haga visible. Centrífuga el tubo a ≥ 10.000 x g durante 5 minutos y retire el sobrenadante. Lave el pellet de ADN con 200 μL de etanol al 70%. Centrífuga el tubo a ≥ 10.000 x g durante 5 minutos y retire el sobrenadante. Seque el tubo en aire durante 10 minutos y luego resuspend el ADN en 50 μL de agua. Realice el PCR genotipado siguiendo el paso 4.7 y gel electroforesis en el paso 4.8 para identificar las líneas celulares, que poseen eliminaciones de los H19- y IG- DMR y están libres de alelos de wildtype.NOTA: Una imagen de un segundo análisis genotipado típico se muestra en la Figura 2B como referencia. En nuestro caso, las 5 líneas celulares seleccionadas después de la purificación celular haploide (paso 5) estaban libres de alelos de tipo salvaje y poseían sólo los alelos de eliminación de los H19- y IG-DMR. Utilice las líneas phaESC sub-clonadas seleccionadas después de este segundo genotipado como líneas DKO-phaESC. 7. Superovulación de ratones Para la producción de ocitos MII, inicie la superovulación mediante inyección intraperitoneal de 5 UI de solución de gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG) en cada ratón hembra B6D2F1 (4-5 semanas de edad) 63-65 h antes de la recolección de oocitos.NOTA: La cepa del ratón B6D2F1 se recomienda para este protocolo porque los ocitos B6D2F1 toleran bien la inyección intracitoplasmática y muestran un alto potencial de desarrollo después del procedimiento17. Cuarenta y ocho horas después de la inyección de PMSG, inyectar por vía intraperitoneally 5 UI de solución de gonadotropina coriónica humana en cada ratón. 8. Colección de ocitos Prepare una placa de 4 pozos que contenga 700 μL de medio hialuronidasa en un pozo y 700 μL de M2 en los 3 pozos restantes. Además, prepara un plato de 6 cm con 7 ml de M2 medio y un plato de centro-pozo con 900 μL de M16 medio. Precalente el plato y los platos a 37 °C en un ambiente de 5% CO2. El día de la inyección intracitoplasmática, eutanasia a las hembras superovuladas (desde el paso 7.2) por dislocación cervical o inhalación de CO2 alrededor de las 8 de la mañana. Disecciona los oviductos usando pinzas y tijeras. Coloque los oviductos en el plato de 6 cm con el medio M2. Suelte los complejos de cúmulos-ócitos (COC) desgarrando la ampolla de los oviductos con una aguja de 30 G. Transfiera los COC al medio hialuronidase precalentado y manténgalo a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Después de 2-3 min, recoger ócitos libres de cúmulos con una pipeta bucal y lavar los ócitos 3 veces transfiriéndolos al medio fresco M2 en los otros 3 pozos de la placa de 4 pozos. Recoge ocitos metafásicos II (MII), que poseen los primeros cuerpos polares, en un plato de centro-pozo con medio M16 y mantén el plato a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5% hasta su uso para inyección intracitoplasmática en el paso 12. 9. Tratamiento y recopilación de DKO-phaESCs Prepare un cultivo DKO-phaESC en un pozo de una placa de 6 pozos sin MEF al 60-80% de confluencia un día antes de la inyección intracitoplasmática (desde el paso 5.11). Para inducir la detención del ciclo celular en fase M, aspirar el medio por completo y añadir 2 ml de medio haESC que contiene 0,05 mg/ml demecolcina. Después de 8 h de tratamiento con demecolcina, aspirar el medio y añadir 800 μL de trippsina. Incubar la placa a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5% durante 5 minutos, luego añadir 2 ml de tampón de lavado para apagar la triptina, y pipeta varias veces para obtener una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrífuga el tubo a 160 x g durante 5 minutos y retire el sobrenadante. Resuspend el pellet celular en 400 μL de búfer de mantenimiento haESC que contiene 15 μg/mL Hoechst 33342. Incubar la suspensión celular a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5% durante 15 min. Después de la incubación, transfiera la suspensión celular a un tubo de 5 ml a través de una tapa del colador celular y mantenga el tubo a 4 °C hasta que la clasificación de la célula en el paso 10. 10. Purificación de DKO-phaESCs detenidos en fase M Configure un cytómetro de flujo con una boquilla de 100 μm de acuerdo con las instrucciones del fabricante.NOTA: Hoechst 33342 se puede detectar por excitación a 405 nm. Aquí, se utiliza un láser UV de 355 nm para la detección de Hoechst 33342. Establecer el DKO-phaESCs detenido en fase M a partir del paso 9.7 e iniciar el análisis. Seleccione una puerta de clasificación adecuada para recoger las células de fase M haploides (2n) de la muestra tratada con demecolcina.NOTA: Después del tratamiento de la demecolcina, se esperan 2 poblaciones celulares, correspondientes a células haploides y diploides detenidas en fase M como se muestra en la Figura 3B. La detención del ciclo celular después del tratamiento con demecolcina está completa, por lo tanto, no se observa ningún pico de ADN haploide 1n. Esto es importante ya que las células haploides de fase M y las células diploides G1 poseen el mismo contenido de ADN (2n) y producirían picos superpuestos. Configure un tubo de 15 ml que contenga 2 ml de búfer de mantenimiento haESC para recoger las celdas ordenadas en el cytómetro de flujo. Inicie la clasificación de celdas. Después de la clasificación celular, agregue 5 ml de búfer de lavado a lo largo de la pared del tubo de recolección. Centrífuga el tubo a 160 x g durante 5 minutos y retire el sobrenadante. Resuspend las células en un volumen adecuado de búfer de mantenimiento haESC para obtener una concentración final de 5 x 105 celdas/ml. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Mantenga el tubo sobre hielo hasta que esté listo para la inyección intracitoplasmática en el paso 12. 11. Preparación de pipetas de sujeción y microinjección NOTA: Para realizar la inyección intracitoplasmática (paso 12), se requieren varias pipetas de sujeción y microinyección(Figura 4A). Estas pipetas se pueden comprar a petición a medida de un proveedor comercial o hechas de capilares de vidrio adecuados utilizando un extractor de micropipette y un microforge. Tire de capilares de vidrio borosilicato en un extractor de micropipette. Para extraer capilares de vidrio borosilicato sin filamento (0,78 x 1,00 x 80 mm) se indican los siguientes parámetros para un extractor horizontal en llamas(Tabla de Materiales)como referencia, pero diferirán para otros instrumentos y tipos capilares de vidrio: Calor 510 (Prueba de rampa 480), Extracción 0, Velocidad 150, Tiempo 175 y Presión 200 para la sujeción de pipetas; Heat 510 (Prueba de rampa 480), Extracción 90, Velocidad 140, Tiempo 125 y Presión 200 para pipetas de microinjeción.NOTA: Los parámetros óptimos deben definirse individualmente porque varios factores, incluyendo la humedad, el modelo de un tirador de micropipette y la gran cantidad de capilares de vidrio pueden afectar la forma de las pipetas de inyección. Se debe apuntar a una forma alargada con una inclinación gradual. Preparación de la celebración de pipetas Ajuste un capilar tirado preparado en el paso 11.1 en un microforge. Coloque el capilar sobre el cordón de vidrio en el filamento y baje el capilar para hacer un contacto con la cuenta de vidrio mientras calienta el filamento. Romper el capilar apagando el calentamiento y desprendiéndose de la cuenta de vidrio de tal forma que su diámetro exterior es de 60-100 μm. Coloque la punta capilar horizontalmente para enfrentarse al cordón de vidrio en el filamento. Caliente el filamento para permitir que el diámetro interno de la punta capilar se derrita a un diámetro de 10-20 μm. Mueva el capilar para que las posiciones de cordón de vidrio en un punto ~ 1 mm de la punta capilar sin contacto. Caliente el filamento para permitir que el capilar se doble en un ángulo de 20°. Desmontar el capilar, denominado pipeta de sujeción, del microforge.NOTA: Para medir el tamaño del capilar, preferiblemente se instala un retícula ocular en el microforge. Preparación de pipetas de microinjección Ajuste un capilar tirado preparado en el paso 11.1 en un microforge. Coloque el capilar sobre el cordón de vidrio en el filamento y baje el capilar para hacer un contacto con la cuenta de vidrio mientras calienta el filamento. Rompa el capilar apagando el calentamiento y desprendiéndose de la cuenta de vidrio en una posición en la que su diámetro exterior es de 6 μm. Mueva el capilar para que las posiciones de cordón de vidrio en un punto ~ 1 mm de la punta capilar sin contacto. Caliente el filamento para permitir que el capilar se doble hacia arriba en un ángulo de 20°. Desmontar la pipeta de microinjección del microforge y almacenarla en una caja segura para su uso posterior.NOTA: Las pipetas de microinjección se preparan con las siguientes especificaciones: diámetro exterior, 6 μm; diámetro interior, 4,5–5 μm; ángulo de flexión, 20°. Definir el diseño óptimo de la pipeta de microinjección es importante para el éxito de la inyección intracitoplasmática. Un diámetro interno demasiado grande puede evitar la rotura de la membrana plasmática del donante DKO-phESCs (ver sección de discusión). Si el diámetro interno es demasiado estrecho, puede impedir la pipeteo suave del donante DKO-phESCs. Un ángulo de pliegue < 30° es preferible ya que un ángulo de pliegue alto impide el efecto de los pulsos piezo. 12. Inyección intracitoplasmática de DKO-phaESCs Antes de la inyección intracitoplasmática (a partir del paso 12.2), prepare una solución de polivinilpirrolidona (PVP) añadiendo 5 ml de medio M2 en un tubo de 50 ml que contenga 0,6 g de PVP y agitando el tubo en un balancín a 4 °C durante 2 días. Después de que el PVP se haya disuelto por completo, la solución se filtra estérilmente y se almacena a 4 °C. El día de la inyección intracitoplasmática, prepara un plato de pozo central con 900 μL de KSOM medio y pre-calienta el plato a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5%. Prepare un plato de micromanipulación alineando gotas de 5 μL de solución PVP y 20 μL de medio M2 en una tapa de un plato de 10 cm que se coloca al revés. Cubra las gotas con aceite mineral y coloque el plato en el escenario del microscopio de inyección.NOTA: La disposición recomendada de la antena de micromanipulación se muestra en la Figura 4B. Instale una pipeta de sujeción en el micromanipulador. Llene la pipeta de microinjeción con el aceite de fluorocarbono mediante una punta de microcargador y colócela en el actuador piezo. Sumerja la pipeta de microinjeción en una gota con solución PVP y pipeta arriba y abajo varias veces para recubrir el vidrio con PVP y hacerlo menos pegajoso. Cargue un pequeño volumen de solución PVP en la pipeta de microinyección y mueva la pipeta a una gota con el medio M2. Sumerja la pipeta de sujeción en el medio M2 y concéntrese en la pipeta en la parte inferior de la gota. Transfiera aproximadamente 2 μL de suspensión DKO-phaESC del paso 10.6 a la caída media M2. Transfiera 10 ócitos MII del paso 8.5 a la misma caída mediana M2 mediante una pipeta bucal. Para inyección, gire un ócito en la caída media M2 para que el espacio perivitellina se enfrente a la pipeta de microinjección, y la placa MII no se encuentra en el camino de la pipeta de microinjección (Figura 4A). Sujete el ócito aplicando presión negativa a través de la pipeta de sujeción.NOTA: Una placa MII se identifica visualmente como una protuberancia de ooplasma que se conoce como una “joroba” y a menudo se encuentra junto al primer cuerpo polar. La placa MII contiene el husillo meiotico con cromosomas unidos. El contacto de la pipeta de microinjección y la placa MII debe evitarse, ya que el daño mecánico del husillo y los cromosomas pueden interrumpir el desarrollo del embrión. Cargue un DKO-phaESC en la punta de la pipeta de microinjección aplicando una presión negativa suave. Romper la membrana plasmática de un DKO-phaESC mediante pipeteo para evitar la inyección de un DKO-phaESC intacto(Figura 3C;ver discusión).NOTA: En caso de que la membrana plasmática de un DKO-phaESC no se rompa por pipeteo, deseche el DKO-phaESC y cargue otro DKO-phaESC. Coloque la pipeta de microinjeción en contacto con la zona pellucida del ócito y aplique una pequeña cantidad de presión negativa dentro de la pipeta de microinjeción. Aplicar impulsos piezo (intensidad, 20; frecuencia, 4) para romper la zona mientras empuja la punta de la pipeta de microinjeción hacia el espacio perivitellina. Confirme que la placa MII, que contiene un husillo y cromosomas, no se encuentra en el camino de la pipeta de microinjeción.NOTA: Ajuste empíricamente el ajuste a los pulsos piezozo más bajos para perforar a través de la zona para minimizar la posibilidad de daños en el oolemma. Deseche el fragmento de la zona pellucida de la pipeta de microinjección y coloque el DKO-phaESC en el borde de la pipeta. Penetrar en el ócito con la pipeta de microinjección para que el oolema llegue al lado opuesto.NOTA: No toque la placa MII para evitar daños en el husillo y los cromosomas. Aplicar un pulso piezo (intensidad, 6; frecuencia, 1) para perforar el oolema. Asegúrese de que el oolemma se relaje a lo largo del eje de la pipeta de microinjección.NOTA: Defina empíricamente el ajuste más bajo del pulso piezozo para romper el oolema para minimizar el daño al ócito. Inyecte la DKO-phaESC con un volumen mínimo de medio en el ooplasma y retire la pipeta de microinjección suavemente del ócito. Suelte el ócito inyectado de la pipeta de sujeción y colóquelo en el lado de la microdrop para su posterior recolección. Repita el procedimiento de inyección de los pasos 12.9 a 12.17 para los otros ócitos MII en la caída media M2.NOTA: Evite mantener los ocitos fuera de la incubadora durante más de 20 minutos. En nuestra experiencia, un lote de 10 ócitos se puede manipular cómodamente en un radio de 15 minutos después del entrenamiento adecuado. Transfiera el lote de ocitos inyectados de la caída media M2 a un plato de pozo central pre-calentado con el medio KSOM. Mantenga el plato durante 1 h a 37 °C en un ambiente de CO2 del 5%. Repita la manipulación de ocitos de los pasos 12.5 y 12.20 con grupos adicionales de ócitos MII para obtener suficientes ócitos inyectados. 13. Activación de embriones semi-clonados construidos Prepare dos platos de centro-pozo con 900 μL cada uno de KSOM medio y medio de activación. Prepare una placa de 4 pozos con 700 μL de medio KSOM en cada pozo. Precalente los platos y el plato a 37 °C en un ambiente de CO2 del 5%. Después de 1 h en el medio KSOM, transfiera los ocitos inyectados del paso 12.21 al plato de pozo central pre-calentado con medio de activación. Mantenga el plato durante 6 h a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5% para la activación. Después de la activación, observar algunos embriones semi-clonados forman tres cuerpos polares, que son el primero y el segundo cuerpo polar del oocito, y el cuerpo pseudo polar de la DKO-phaESC (Figura 3E). Lave los embriones 3 veces transfiriéndolos a nuevos pozos con el medio KSOM en una placa de 4 pozos. Transfiera los embriones al plato central con el medio KSOM y mantenga el plato a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5% para un mayor desarrollo. 14. Desarrollo de embriones semi-clonados construidos Después de 1 día de cultivo en el medio KSOM desde el paso 13.6, varios embriones semi-clonados llegan a la etapa de 2 células (Figura 5A). Para un mayor desarrollo de embriones preimplantacionales in vitro, continúe culturando los embriones semi-clonados en el medio KSOM a 37 °C en una atmósfera de CO2 del 5%. Transfiera los embriones semi-clonados al medio fresco KSOM en el día 2. En el día 4, varios embriones llegarán a la etapa de blastocista(Figura 5A). Para la derivación de ratones semi-clonados, transfiera embriones de 2 células del paso 14.1 a los oviductos de las hembras receptoras pseudo-embarazadas. Identificar a las hembras pseudo-embarazadas apareándose a machos vasectomizados un día antes de la transferencia del embrión y seleccionarlas sobre la base de la presencia de un tapón claramente visible en la mañana del día para la transferencia del embrión (0,5 días después del coitum (dpc)). Alrededor de 19.5 dpc, cachorros a término se entregan naturalmente de las hembras receptoras (Figura 5B).