Immersione alternativa nel glucosio per produrre iperglicemia prolungata in Zebrafish
Summary
Questo protocollo induce in modo non invasivo l’iperglicemia nel pesce zebra per un massimo di 8 settimane. Utilizzando questo protocollo, è possibile fare uno studio approfondito degli effetti avversi dell’iperglicemia.
Abstract
I pesci zebra (Danio rerio) sono un modello eccellente per indagare gli effetti dell’iperglicemia cronica, un segno distintivo del diabete mellito di tipo II (T2DM). Questo protocollo ad immersione alternativa è un metodo non invasivo e step-wise per indurre iperglicemia per un massimo di otto settimane. I pesci zebra adulti sono alternativamente esposti allo zucchero (glucosio) e all’acqua per 24 ore ciascuno. Il pesce zebra inizia il trattamento in una soluzione di glucosio all’1% per 2 settimane, quindi una soluzione al 2% per 2 settimane e infine una soluzione al 3% per le restanti 4 settimane. Rispetto ai controlli trattati con acqua (stress) e trattati con mannitolo (osmotico), i pesci zebra trattati con glucosio hanno livelli significativamente più elevati di zucchero nel sangue. Il pesce zebra trattato con glucosio mostra livelli di zucchero nel sangue 3 volte superiori a quello dei controlli, suggerendo che dopo quattro e otto settimane l’iperglicemia può essere raggiunta. L’iperglicemia sostenuta è stata associata all’aumento della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e all’aumento dei livelli di fattore nucleare Kappa B (NF-kB) nella retina e alla diminuzione delle risposte fisiologiche, così come i deficit cognitivi che suggeriscono che questo protocollo può essere utilizzato per modellare le complicanze della malattia.
Introduction
Il pesce zebra(Danio rerio)sta rapidamente diventando un modello animale ampiamente utilizzato per studiare sia la malattia che la cognizione1. La facilità di manipolazione genetica e la trasparenza embrionale attraverso le prime fasi di sviluppo, li rendono un candidato principale per studiare le malattie umane con una base genetica nota. Ad esempio, i pesci zebra sono stati utilizzati per studiare la sindrome di Holt-Oram, le cardiomiopatie, la malattia renale glomerulocistica, la distrofia muscolare e il diabete mellito (DM) tra le altremalattie 1. Inoltre, il modello zebrafish è ideale per le piccole dimensioni della specie, la facilità di manutenzione e l’elevata fecondità2,3.
Il pancreas zebrafish è sia anatomicamente che funzionalmente simile al pancreas di mammiferi4. Pertanto, le caratteristiche uniche di dimensioni, alta fecondità e strutture endocrine simili rendono zebrafish un candidato adatto per lo studio delle complicanze legate alla DM. Nel pesce zebra, ci sono due metodi sperimentali utilizzati per indurre l’iperglicemia prolungata che è caratteristica del DM: un afflusso di glucosio (modellazione di tipo 2) e la cessazione della secrezione di insulina (modellazione tipo 1)5,6. Sperimentalmente, per fermare la secrezione di insulina, le cellule β pancreatiche possono essere distrutte chimicamente usando iniezioni di Streptozotocina (STZ) o Alloxan. STZ è stato utilizzato con successo nei roditori e nei pesci zebra, con conseguenti complicazioni associate alla retinopatia7,8,9,deficit cognitivi10e rigenerazione degli arti11. Tuttavia, nel pesce zebra, β-cellule si rigenerano dopo il trattamento, causando la necessaria “iniezione di richiamo” di STZ per mantenere le condizioni diabetiche12. In alternativa, il pancreas del pesce zebra può essere rimosso6. Si tratta sia di procedure altamente invasive, dovute alle iniezioni multiple, sia di un ampio tempo di recupero.
Al contrario, l’iperglicemia può essere indotta in modo non invasivo attraverso l’esposizione al glucosio esogeno. In questo protocollo, i pesci sono immersi in una soluzione di glucosio altamente concentrata per 24 ore5,13 o continuamente per 2 settimane14,15,16. Il glucosio esogeno viene assunto transdermicamente, per ingestione e/o attraverso le branchie con conseguente elevati livelli di zucchero nel sangue. Poiché questa tecnica non invasiva non manipola direttamente i livelli di insulina, non può pretendere di indurre il DM di tipo 2. Tuttavia, può essere utilizzato per esaminare le complicanze indotte dall’iperglicemia, che è uno dei principali sintomi del DM di tipo 2.
Recentemente, il mutante zebrafish pdx1-/- è stato sviluppato manipolando il gene pancreatico e duodenale omeobox 1, un gene legato alla causa genetica del DM di tipo 2 nell’uomo. Utilizzando questo mutante, i ricercatori sono stati in grado di replicare l’interruzione dello sviluppo pancreatico, l’alto livello di zucchero nel sangue e studiare la retinopatia diabetica indotta da iperglicemia17,18.
In questo articolo, descriviamo un metodo di induzione dell’iperglicemia non invasiva che utilizza un protocollo ad immersione alternata. Questo protocollo mantiene condizioni iperglicemiche per un massimo di 8 settimane con complicazioni successive osservate. In breve, i pesci zebra adulti vengono posti in una soluzione di zucchero per 24 ore e quindi in una soluzione d’acqua per 24 ore. A differenza dell’immersione continua in soluzioni esterne di glucosio, alternare giorni tra zucchero e acqua imita l’aumento e la caduta della glicemia nel diabete. Un protocollo di glucosio alternato consente inoltre di indotta l’iperglicemia per periodi di tempo più lunghi, poiché i pesci zebra non sono così in grado di compensare le elevate condizioni esterne di glucosio. Come prova di principio, forniamo dati che mostrano che l’iperglicemia indotta usando questo protocollo altera la chimica retinica e la fisiologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il diabete è un problema nazionale. Gli studi dimostrano che entro il 2030, si stima che 400 milioni di persone avranno una qualche forma di diabete. Nei modelli di roditori, il DM di tipo 2 viene studiato utilizzando la manipolazione genetica. Nei ratti, i ratti grassi diabetici Zucker (ZDF) e i ratti grassi Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), forniscono maggiori informazioni sugli effetti del tipo 2 DM10. Inoltre, diete ad alto contenuto di grassi sono state utilizzate nei roditori per indurre…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere VPC, CJR e MCP per lo sviluppo di questo protocollo. L’EMM ha ricevuto sostegno finanziario dall’American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support per svolgere questa ricerca. Questo lavoro è stato anche supportato da un American University Faculty Mellon Award e finanziamenti attraverso l’American University College of Arts and Sciences (entrambi a VPC).
Materials
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
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