Entrega directa de medicamentos al riñón a través de la arteria renal
Summary
Este manuscrito describe un método para el parto selectivo a un solo riñón a través de un catéter colocado en la aorta abdominal infrarenal en el ratón.
Abstract
Existe la necesidad de inyecciones dirigidas para permitir una mayor y específica exposición renal para una evaluación eficiente de las dianas farmacológicas en el campo de la investigación renal. La acumulación de fármacos en ciertos órganos puede dar lugar a efectos adversos y no deseados, dependiendo de la naturaleza del inyector. Para minimizar el contagio y/o la acumulación en otros tejidos, el método descrito en el presente documento dirige la formulación al torrente sanguíneo de la arteria renal mediante la inserción de un catéter en la aorta infra renal, justo debajo de donde se ramifica en la arteria renal, lo que resulta en el riñón como órgano alcanzado por primera vez y la distribución de la formulación en todo el riñón.
Este manuscrito proporciona una descripción detallada del método, así como sus desafíos y dificultades. Guía al experimentador a ser hábil con este tipo de microcirugía que requiere precisión en condiciones estériles. La velocidad es crucial para minimizar la isquemia y practicar el procedimiento aumentará la probabilidad de inyecciones exitosas sin efectos adversos. Al modular el tiempo entre la inyección y la reperfusión, así como el volumen inyectado, se mitiga el riesgo de contagio a otros órganos.
Tenga en cuenta que esta técnica es adecuada para estrategias de dosificación única.
Introduction
En el campo de la investigación preclínica dentro de la industria farmacéutica, el desarrollo de modelos y métodos es parte del trabajo diario. Existe un creciente interés por la capacidad de dirigir fármacos a órganos específicos, o incluso compartimentos separados de un órgano, sin derrames/atrapamientos importantes, a través del torrente sanguíneo, en otros tejidos. Esto para permitir una mayor y específica exposición para la evaluación eficiente de las dianas farmacológicas en modelos de diferentes áreas de enfermedad 1,2,3,4.
Una forma común de suministrar sustancias es por rutas sistémicas (por ejemplo, a través de la vena de la cola) ya que es menos invasiva que el método descrito en este manuscrito. Sin embargo, la administración sistémica aumenta el riesgo de aumento del metabolismo o acumulación del compuesto en otros tejidos que el órgano objetivo previsto, al pasar por órganos filtrados como el pulmón, el hígado y el bazo 2,3,5. Además de no llegar al tejido destinado, esto potencialmente podría dar lugar a efectos adversos y/o no deseados, dependiendo de la naturaleza del inyector. Sólo moléculas muy pequeñas pasan los capilares de los órganos filtrantes y por lo tanto el parto dirigido es especialmente importante si se trabaja con moléculas más grandes 6.
Para minimizar el contagio y/o la acumulación de formulación inyectada, en otros tejidos, el método descrito en este documento dirige la formulación al torrente sanguíneo de la arteria renal a través de un catéter insertado en la aorta abdominal justo debajo de donde se ramifica en la arteria renal, lo que resulta en el riñón como órgano primero alcanzado. Otra ventaja con esta administración guiada es que se puede utilizar una dosis/volumen más bajo para alcanzar el mismo nivel de exposición que se logra a través de la administración sistémica 3.
Se han explorado otras vías de administración, por ejemplo, inyecciones a través de un catéter directamente en la arteria renal. En nuestras manos, se encontró que esto presentaba un mayor riesgo de no restaurar la circulación al riñón. El diámetro muy pequeño de la arteria renal (aproximadamente 0,35-0,55 mm de diámetro) hace que la incisión sea relativamente grande y represente un riesgo de obstrucción y/o embolia al cerrar el orificio de entrada. De acuerdo con nuestra experiencia daño relacionado isquémico al riñón a menudo ocurrió cuando se utiliza este método, y por lo tanto desarrollamos esta nueva forma de dirigirse con éxito al riñón mediante la inyección de sustancias a través de la incisión de la aorta más grande para dirigirse al riñón.
Hay técnicas similares que se están desarrollando en ratas que también manifiesta los desafíos y el riesgo de estenosis/trombosis trabajando con inyecciones directamente en la arteria renal 5. Esto apoya nuestros hallazgos ya que los vasos en ratones son aún más pequeños.
Este manuscrito y video describen, en detalle, cómo las inyecciones pueden dirigirse a la arteria renal en ratones a través de un catéter insertado en la aorta infrarenal, así como orientación sobre cómo superar las dificultades comunes en el procedimiento, trabajar de la manera más segura posible y así aumentar la reproducibilidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método ha tenido éxito en la entrega de formulaciones al riñón sin causar daño renal. Se puede utilizar para la entrega de cualquier tipo de formulaciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, células madre/progenitoras o microvesículas). El método se puede aplicar en animales sanos o en modelos de enfermedad renal.
En la Figura 2 y figura 3,se presenta la histología. La Figura 2 muestra histología 180 minutos después de la perfusión, mientras que la Figura 3 muestra el historial 7 días después de la perfusión. La razón de esto es que los experimentos con la arteria renal duraba sólo 180 minutos. Para estar seguros de que no tuvimos daños crónicos con este nuevo método, esperamos deliberadamente 7 días para evaluarlos. El número n es pequeño, pero esto es sólo un ejemplo.
Tenga en cuenta que este método recientemente desarrollado de administración de aorta para dirigirse al riñón es un método invasivo con un rendimiento relativamente bajo y es adecuado para estrategias de dosificación única solamente. La dosificación repetida no es posible con este método.
Con ajustes menores de las colocaciones de ligadura este método podría ser utilizado para infundir ambos riñones simultaniously5,7. Con el mayor riesgo de contagio a través de ramificaciones aórticas decidimos mantener la ligadura ocluyente lo más cerca posible del riñón, llevando la inyección al riñón izquierdo solamente. También se puede utilizar además de otros modelos o técnicas como la uninephrectomía o tal vez incluso la lesión simultánea de reperfusión de isquemia renal (IRI). En nuestra opinión, hacer la inyección sólo 24 horas después de la cirugía IRI3 es demasiado duro y afectará sustancialmente la recuperación del animal.
Cuando se utilizan nuevas cepas de ratones, siempre se debe realizar un experimento piloto en algunos animales de esa cepa para asegurarse de que el método no necesita ser ajustado de alguna manera. Por ejemplo, en algunas cepas la ramificación del recipiente desde la aorta se puede colocar un poco diferente. La posición de las ligaduras puede cambiar un poco para asegurarse de que la formulación termina en el lugar correcto.
deshidratación
Abrir la cavidad abdominal representa un gran riesgo de deshidratación. Por lo tanto, es imperativo añadir líquidos (alrededor de 37 °C) durante y después de la cirugía para garantizar una buena base para la recuperación después de la operación. Normalmente damos 1 ml/ratones.c. después de la cirugía.
isquemia
El tiempo prolongado de la cirugía o si no alcanza la recirculación completa dará lugar a isquemia. Es importante registrar el tiempo real de la isquemia y asegurarse de que se restablezca la circulación al riñón (y a las patas traseras). El entrenamiento constante y la actualización de las habilidades son, como siempre, importantes. Realizar el procedimiento más rápido reduce el tiempo que el riñón está expuesto a la isquemia. Mantener el tiempo de isquemia (ligadura de aorta) a alrededor de 5 min (10 min máx.) se ha demostrado que no daña el riñón.
derrame
Teniendo en cuenta el riesgo de contagio a otros órganos cuando la formulación inyectada está reingrándose a la circulación a través de la vena renal, el volumen inyectado debe mantenerse al mínimo. Recomendamos un volumen máximo de 50 μL. Dosis también se ha encontrado, por otros, para ser un factor crítico para la eficiencia3.
Efectos adversos (trombosis y parálisis)
Inicialmente al configurar el modelo experimentamos problemas no consistentes con parálisis en las piernas traseras. Después de la dosis relevante de anticoagulante (10 UI de heparina en la vena de la cola) preoperatoriamente, este efecto adverso se redujo significativamente. Después de consultar a expertos en el campo, también empezamos a ser aún más cuidadosos en el trabajo con cirugía atraumática, lo que significa que no pellizcar en ningún tejido y tocar las áreas lo menos posibles. Estas medidas adoptadas juntas redujeron la frecuencia de parálisis de alrededor del 50% a prácticamente ninguna.
Inicialmente durante el desarrollo del método, aplicamos tejido anticoagulante en la arteria renal para cerrar el agujero de incisión. Esto no fue posible al hacer inyecciones en la aorta ya que la presión es mucho mayor en la aorta. El anticoagulante también aumenta el riesgo de trombosis si entra en el lúmenes del recipiente.
Asegúrese de no tener adventitia expuesta en el lúmenes de la aorta al suturar ya que la adventitia es muy trombogénica. También evite cualquier invertir los bordes de la herida o estrechar la aorta suturando al muslo.
Ahora tenemos un método establecido para entregar formulaciones directamente al riñón.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gracias a René Remie en RRSSC por ayudarme a afinar la técnica y los laboratorios Instech para la colaboración en la producción de un catéter de diseño especial. Un gran agradecimiento también a todos los colegas de AstraZeneca I+D para discusiones productivas con consejos y trucos, así como Xerox para completar el vídeo con sonido.
Materials
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
Referenzen
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
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- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
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