Улучшенный анализ и инструменты для измерения механического ноцицепции в Drosophila Larvae
Summary
Цель этого протокола состоит в том, чтобы показать, как выполнить улучшенный анализ механического ноцицепции в личинках дрозофилы. Мы используем анализ здесь, чтобы продемонстрировать, что механическая гиперчувствительность (алдиния и гипералгезия) существует в личинках дрозофилы.
Abstract
Опубликованные анализы механического ноцицепции в Дрозофиле привели к переменным оценкам поведения. Здесь мы изготовили для использования личинки дрозофилы, индивидуальные металлические никель-титановые сплавы (нитинол) нити. Эти механические зонды похожи на нити фон Фрея, используемые у позвоночных для измерения механического ноцицепции. Здесь мы демонстрируем, как сделать и откалибровать эти механические зонды и как создать полную поведенческую дозу-ответ от подтресхолдинга (безобидный или не-вредный диапазон) до надтраста (низкий и высокий вредный диапазон) стимулов. Чтобы продемонстрировать полезность зондов, мы исследовали повреждения тканей индуцированной повышенной чувствительности в личинках дрозофилы. Механическая алдиния (гиперчувствительность к обычно безобидному механическому стимулу) и гипералгезия (преувеличенная отзывчивость к вредным механическим стимулом) еще не установлены в личинках дрозофилы. Используя механические зонды, которые обычно безобидны или зонды, которые обычно вызывают аверсивное поведение, мы обнаружили, что личинки дрозофилы развивают механическую гиперсензитизацию (как алдинию, так и гипералгезию) после повреждения тканей. Таким образом, механические зонды и анализы, которые мы здесь иллюстрируют, вероятно, будут важными инструментами для вскрытия фундаментальных молекулярно-генетических механизмов механической гиперчувствительности.
Introduction
Личинки дрозофилы обладают характерным аверсивным поведением при воздействии различных вредныхраздражителей: тепловых 1,механических 2ихимических 3. Такое поведение явно отличается от нормального передвижения. Здесь мы описываем улучшенный механический анализ, который может быть использован для оценки механического ноцицепции и механической сенсибилизации.
В недавнем исследовании, мы изготовили фон Фрей-как нити с использованием нитинол провода4. Зонды, прилагающие различные силы и давление, были сделаны путем изменения длины и диаметров нитинол провода формирования каждого зонда. Механические зонды были откалиброваны и измеренные значения силы (в millinewton, mN) были преобразованы в давление (kilopascal, kPa), на основе области наконечника каждогозонда 4. Таможенное изготовление механических зондов позволило нам генерировать субтрестойное (≤200 кПа) до надтраста (225 кПа до 5318 кПа) давления, что в принципе могло бы быть полезно для изучения механической гиперчувствительности. Используя эти улучшенные механические фон Фрей-как нити, мы показали,что давление 4, в отличие от ранееисследованной силы 2,5,6 коррелирует более последовательно с аверсивной поведенческой отзывчивости в личинках дрозофилы. Улучшенный механический анализ, описанный здесь, также помог определить сохраненный сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) связанный с рецептором тирозинкиназы, сигнализирующий о пути, который регулирует механическое ноцицепция у мух икрыс 4.
Механическая алдиния и гипералгезия, два условия повышенной чувствительности, относительно недостаточно изучены в личинках дрозофилы, по сравнению с тепловыми (тепло и холод) и химическими сенсорнымимодальности 3,7,8,9,10. Это, вероятно, из-за отсутствия конкретных механических зондов, которые охватывают от безобидных стимуловдо высокого вредных диапазон 2,5,6. Обычно безобидный стимул, который вызывает типичный аверсивное поведение прокатки после drosophila личинки опыт повреждения тканей 3,7 называется allodynia. Преувеличенный подвижной ответ на обычно вредный стимул известен как гипералгезия7. Вредные стимулы определяются как те, которые вызывают повреждение тканей и могут активировать ноцицепторы11. Вредные стимулы доставлены личинки Drosophila повреждения либо барьер эпидермиса, периферических ноцицептивных сенсорныхнейронов 3,4,7, или оба.
В этой статье мы демонстрируем, как на заказ изготавливать и калибровать механические зонды типа фон Фрея, подходящие для личинок дрозофилы. Кроме того, мы показываем, как использовать эти зонды для анализа механических ноцицептивных реакций в личинках дрозофилы. Наконец, мы дополнительно продемонстрировать полезность этих зондов, используя их, чтобы продемонстрировать наличие механической гиперчувствительности, как алдиния и гипералгезия, после повреждения тканей в личинках дрозофилы (см. Представитель Результаты).
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы модифицировали установленный механическийанализ 1,2,16 сиспользованием индивидуальных механических зондов, изготовленных из нитинолных нитей. Этот металлический сплав позволяет нам использовать нити меньшего диаметра, соответствующие размеру личинок дрозофилы. Рыболовные линии на основе монофиламентов доминировали в области мухи механического ноцицепции на сегодняшний день2,5,6,16. Наши нити нитинола поддерживают свою форму и измеряют давление в течение примерно 3-5 месяцев (по нашему опыту). Изменяя длину и диаметр нитинол нитей, пользователь может генерировать широкий спектр давлений, охватывающих от подтресхолдинга до почти полного подвижного ответа. В частности, сделать подтресхолдинг зондов проще с меньшим диаметром нитинол нити. Используя эти зонды, мы обнаружили, что давление, а не сила, вызывает более последовательные ноцифенсивные поведенческие реакции4. Мы демонстрируем здесь, используя устоявшуюся УФ-индуцированной ноцицептивноймодели сенсибилизации 7,10,13, что эти нити также являются полезным инструментом для изучения механической гиперчувствительности-алдодиния и гипералгезия.
Предыдущие исследования с использованием механических зондов, изготовленных из лески, привели к определеннойизменчивости в поведенческой отзывчивости 2,6,16,17. Это может быть причиной нескольких факторов. Во-первых, поскольку давление является важной переменной, полировка кончика нити так, что она округляется и не имеет каких-либо острых краев имеет решающее значение. Во-вторых, отчетность значения давления, а не только силы имеет важное значение для воспроизводимости экспериментов, потому что различные механические зонды, которые генерируют аналогичные силы могут вызвать разрозненноедавление 4. В-третьих, очень важно применять только одну механическую стимуляцию на личинку с помощью вредных зондов, потому что такие зонды производят дозозависимыеповреждения тканей на эпидермальных 4 и сенсорных нейрональных уровнях(рисунок 2E). Второй или последующий вредный механический стимул, после повреждения тканей был вызван, может предположительно ухудшить функцию пострадавших периферических сенсорных нейронов и вызвать измененную поведенческую реакцию. В другом исследовании личинки стимулировали дважды с вредными механическими зондами в основномотображается повышенная поведенческая реакция 5, предполагая развитие острой механической сенсибилизации (гипералгезия), которые могут возникнуть в результате повреждения тканей, спровоцированных первым вредным механическим стимулом. И наоборот, другиеавторы 6 сообщили смешанные (увеличение или снижение) поведенческой реакции, указывая, что измененная поведенческая реакция может быть связано с повреждением / дисфункции нейронной ткани. Стимулирование каждой личинки только один раз устраняет возможную дисперсию в поведенческих реакций в результате сенсибилизации или повреждения тканей. В-четвертых, мы механически стимулировали сегмент A8, который является более задним, чем предыдущие исследования (предпочтительные области A3-A4)2,5,16. Зонды между 3900 кПа и 5300 кПа применяется либо сегмент A2 или A8 не показывают каких-либо поведенческих различий4. Кроме того, A8, по сравнению с A2-A4, легче стимулировать с помощью механических зондов, которые генерируют более низкое давление (<300 кПа), потому что личинка тоньше в этой области и, следовательно, легче сжимается. Другие исследования показали, что вредные механической стимуляции задней части личинки (поставляется жесткой булавкой насекомых, состоявшейся с типсами) в основном вызвали вперед передвижения, а не обратный или подвижногоответа 18. Эта различная поведенческая реакция может быть вызвана различиями в свойствах использованных материалов (сгибаемая нитиноловая нитья против неудержимого насекомого штифта) или различным давлением, поставляемым личинкам (значение давления булавки насекомого не сообщалось).
Развитие механического анализа ноцицепции для личинок дрозофилы позволило области обнаружить, что различные механические сенсорные ионные каналы и нейронные цепиопоясыв механическое ноцицепцию 5,6,16,17. Однако изучение механической гиперчувствительности (алдения и гипералгезия) запаздывание, по сравнению с сенсибилизацией других сенсорных условий –тепла 7,8,10,13,14,холода9ихимической 3. Это отставание может быть отчасти связано с отсутствием подходящих механических зондов, которые могут генерировать полный диапазон реакции, охватывающий подтяза к надтрастанию давления. Особое значение, особенно для оценки механической алодинии, имеют подпорные зонды, которые не вызывают аверсивного подвижного ответа от невредимых личинок. Значение наших усовершенствованных механических зондов заключается в том, что они могут быть изготовлены, чтобы охватить безобидные стимулы (субтресхолд 174 кПа-200 кПа) или низкий и высокий вредный диапазон (надтресхолд 225 кПа до 5116 кПа). Здесь мы демонстрируем с помощью нитинола фон Фрей, как нити, что личинки дрозофилы развивать как механические алодинии и механической гипералгезии после УФ облучения. Механическая сенсибилизация показывает некоторые различия по сравнению с тепловой сенсибилизацией. Как начало, так и пик механической сенсибилизации приходится на более ранние (4 ч) по сравнению с тепловой (тепловой) сенсибилизацией (8 ч для гипералгезии и 24 ч для алодинии)7. Кроме того, механическая алодиния и гипералгезия являются сопутствующими (оба пика на 4 ч). Кроме того, в то время как теплочувствительность (алдиния и гипералгезия) разрешает полностью в болеепоздние моменты времени 7, механическая гиперчувствительность выставлены длинный хвост, который остался немного выше базового уровня. Холодная сенсибилизация в Дрозофиле включает в себя переключательв холодном поведении 9 и появление новых холодных вызванных поведения- явление, которое не наблюдается с механической стимуляции. Эти различия в начале, продолжительности и наблюдаемом поведении свидетельствуют о том, что каждый сенсорный модальности может контролироваться различными сигнальными путями. Сочетание анализа сенсибилизации, описанного здесь, с мощными генетическими инструментами, доступными в Дрозофиле, должно позволить точное генетическое вскрытие наблюдаемой механической гиперчувствительности (алдения и гипералгезия).
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Томаса Вана за разработку прототипа нитей фон Фрея, Патрика Дж. Хуанга за улучшение механического анализа зондов, Центра запасов Bloomington Drosophila Stock Center для управления(w1118) и ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP, а также сотрудников лаборатории Галко за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана R21NS087360 и R35GM126929 в MJG.
Materials
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
| Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
| Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
| Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
| Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
| Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
| Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
| Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
| Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
| Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
| Microscope Cover Glass 22×22 | Fisher | 12-545-B | |
| Microscope Cover Glass 22×40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
| Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
| Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
| Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
| Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
| Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
| W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
| ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |
Referenzen
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. Painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).
- Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. An assay for chemical nociception in Drosophila larvae. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).
- Lopez-Bellido, R., et al. Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates. Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).
- Hu, C., et al. Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior. Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).
- Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception. Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1. PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. eLife. 4, 10735 (2015).
- Cervero, F., Merskey, H. What is a noxious stimulus. Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).
- Follansbee, T. L., et al. Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway. Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).
- Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).
- Jo, J., et al. Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization. Cell Death & Disease. 8 (5), 2786 (2017).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception. Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).
- Takagi, S., et al. Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila. Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).
