이 프로토콜의 목표는 Drosophila 애벌레에서 기계적 고치에 대한 향상된 분석법을 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 우리는 기계적 과민성 (알로디니아 및 과민증)이 Drosophila 애벌레에 존재한다는 것을 보여주기 위하여 여기에서 분석기를 이용합니다.
Drosophila에서 기계적 고치에 대한 출판 된 소명은 행동의 변수 평가로 이어졌습니다. 여기에서, 우리는 Drosophila 애벌레, 맞춤형 금속 니켈 티타늄 합금 (nitinol) 필라멘트로 사용하기 위해 제작했습니다. 이러한 기계식 프로브는 기계식 고드름을 측정하기 위해 척추동물에 사용되는 폰 프레이 필라멘트와 유사합니다. 여기에서, 우리는 이 기계적인 프로브를 만들고 보정하는 방법 및 subthreshold (무해하거나 비 유해한 범위)에서 suprathreshold (낮은 내지 높은 유해 범위) 자극에 전체 행동 복용량 반응을 생성하는 방법을 보여줍니다. 프로브의 유용성을 입증하기 위해 드로소필라 애벌레에서 조직 손상 유발 과민증을 조사했습니다. 기계적 동종증 (일반적으로 무해한 기계적 자극에 과민성) 및 과민증 (유해 한 기계적 자극에 과장 된 응답성) 아직 Drosophila 애벌레에 설립 되지 않았습니다. 일반적으로 무해한 또는 일반적으로 역경 행동을 유도하는 프로브인 기계프로브를 사용하여, 우리는 Drosophila 애벌레가 조직 손상 후에 기계적인 과민증(알로디아 및 hyperalgesia 둘 다)을 개발한다는 것을 것을을 발견했습니다. 따라서, 우리가 여기에서 설명하는 기계적인 프로브 및 분석은 기계과민증의 근본적인 분자/유전 기계장치를 해부하는 중요한 공구일 것입니다.
드로소필라 유충은 다른 유해 자극에 노출될 때 특징적인 역경압 거동을 나타낸다: 열1,기계2,및화학3. 이 동작은 정상적인 운동과 분명히 다릅니다. 여기서 우리는 기계적 고드름과 기계적 감도를 평가하는 데 사용할 수있는 향상된 기계적 분석서를 설명합니다.
최근 연구에서, 우리는 nitinol 와이어 4를 사용하여 폰 프레이 같은 필라멘트를조작했다. 서로 다른 힘과 압력을 가하는 프로브는 각 프로브를 형성하는 니티놀 와이어의 길이와 직경을 변화시킴으로써 만들어졌습니다. 기계 프로브는 보정되었고 측정된 힘 값(밀리뉴턴, mN)은 각 프로브4의팁 영역에 기초하여 압력(kilopascal, kPa)으로 변환되었다. 기계 프로브의 사용자 정의 제작은 원칙적으로 기계적 과민증을 연구하는 데 도움이 될 수있는 섭문턱 (225 kPa ~ 5318 kPa) 압력에 하위 임계 값 (≤200 kPa)을 생성 할 수 있었습니다. 이러한 향상된 기계식 폰 프레이와 같은 필라멘트를 사용하여, 우리는 압력4,이전에 검사 된 힘2,5,6 Drosophila 애벌레에서 회선 행동 반응과 더 일관되게 상관 관계가 있음을 보여 주었다. 여기에서 기술된 향상된 기계 분석법은 또한 파리와쥐에있는 기계적 고드름을 조절하는 통로를 신호하는 보존된 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)관련 수용체 티로신 키나아제 4를 확인하는 데 도움이 되었다.
기계적 알로디니아 및 과민증, 과민증의 두 가지 양식은 열 (열 및 감기) 및 화학 감각 양식3,7,8,9,10에비해 드로소필라 애벌레에서 상대적으로 저술된다. 이것은 아마도 무해한 자극에서 높은 유해범위2,5,6에걸쳐 특정 기계적 프로브의 부족 때문일 것이다. Drosophila 애벌레 경험 조직 손상3,7 후 전형적인 역경 압연 거동을 유도 하는 일반적으로 무해한자극은알로디니아로 지칭된다. 전형적으로 유해한 자극에 대한 과장된 압연 반응은 고간증7로알려져 있다. 유해 자극은 조직 손상을 유도하고 nociceptors(11)를활성화할 수 있는 것으로 정의됩니다. 드로소필라 애벌레에 전달된 유해자극은 장벽 표피, 말초 암각 감각 뉴런3,4,7또는둘 다 손상이다.
이 기사에서는 Drosophila 애벌레에 적합한 폰 프레이와 같은 기계 프로브를 맞춤 제작하고 교정하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 Drosophila 애벌레에서 기계적 nociceptive 반응을 분석하기 위해 이러한 프로브를 사용하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 또한 기계적 과민증의 존재를 입증하기 위해 그들을 사용하여 이러한 프로브의 유용성을 보여줍니다, 알로디니아와 과뇌증, Drosophila 애벌레에서 조직 손상에 따라 (대표 결과참조).
니티놀 필라멘트에서 제작된 맞춤형 기계 프로브를 사용하여 확립된 기계 분석1,2,16을 수정했습니다. 이 금속 합금은 우리가 Drosophila 애벌레의 크기에 적합한 작은 직경 필라멘트를 사용할 수 있습니다. 낚시 라인 기반의 모노필라멘트는 현재까지 플라이 기계식 고치름의 필드를 지배했다2,5,6,16. 우리의 니티놀 필라멘트는 약 ~ 3-5 개월 동안 모양과 측정 된 압력을 유지합니다 (우리의 경험에서). 니티놀 필라멘트의 길이와 직경을 변화시킴으로써 사용자는 서브 임계값에서 거의 완전한 롤링 응답에 이르는 광범위한 압력을 생성할 수 있습니다. 특히, 서브 임계 값 프로브를 만드는 것은 작은 직경 nitinol 필라멘트로 간단합니다. 이러한 프로브를 사용하여, 우리는 압력이 힘보다는, 더 일관된 nocifensive 행동 응답4를유도한다는 것을 것을을 발견했습니다. 우리는 이 필라멘트가 기계적 과민성-알로디니아 및 과발게증을 연구하는 데 유용한 도구라는 것을 잘 확립된 UV 유도 향각 감질 모델7,10,13을사용하여 여기에서 시연합니다.
낚시 라인에서 가공된 기계프로브를 이용한 이전 연구는 행동반응성 2,6,16,17에서일정한 변동성을 초래했다. 몇 가지 요인이 이를 설명할 수 있습니다. 첫째, 압력이 중요한 변수이기 때문에 필라멘트 팁의 강화가 반올림되고 날카로운 모서리가 없는 것이 중요합니다. 둘째, 유사한 힘을 생성하는 다른 기계적 프로브가 서로 다른 압력4를유도할 수 있기 때문에 힘만이 아니라 압력 값을 보고하는 것이 실험의 재현성에 중요하다. 셋째, 유해 프로브를 사용하여 유충당 하나의 기계적 자극만 적용하는 것이 중요하며, 이러한 프로브는 표피4 및 감각 신경 수준에서 용량 의존적 조직 손상을 생성하기 때문이다(도2E). 두 번째 또는 후속 유해 기계적 자극, 조직 손상이 유도 된 후, 생각할 수 영향을받는 말초 감각 뉴런의 기능을 손상하고 변경 된 행동 반응을 유도 할 수 있습니다. 또 다른 연구에서는 유해 기계 프로브로 두 번 자극된 애벌레는 주로 향상된 행동 반응5를표시하여 급성 기계적 감쇠(hyperalgesia)의 개발을 제안하며, 이는 첫 번째 유해 기계적 자극에 의해 유발된 조직 손상으로 인해 발생할 수 있습니다. 반대로, 다른 저자6 혼합 보고 (증가 또는 감소) 행동 반응, 변경 된 행동 응답 신경 조직의 손상/기능 장애 때문일 수 있습니다 나타내는. 각 애벌레를 한 번만 자극하면 민감화 또는 조직 손상으로 인한 행동 반응의 가능한 분산을 제거합니다. 넷째, 우리는 기계적으로 자극 세그먼트 A8, 이는 이전 연구보다 더 후방 (선호 영역 A3-A4)2,5,16. ~3,900kPa와 5,300kPa 사이의 프로브는 세그먼트 A2 또는 A8에 적용되어 행동 차이4를나타내지 않았다. 또한 A8은 A2-A4에 비해 유충이 이 지역에서 더 얇아지고 압축하기 때문에 낮은 압력(<300 kPa)을 생성하는 기계 프로브로 자극하기가 더 쉽습니다. 다른 연구는 유충의 후방 끝의 유해 한 기계적 자극 (강성 곤충 핀에 의해 전달, 집게로 개최) 주로 전방 운동을 불러 일으켰다, 오히려 배설또는 압연 응답(18). 이러한 상이한 행동 반응은 중고 물질의 특성(구부릴 수 있는 니티놀 필라멘트 대 비압축곤충 핀)의 특성이나 유충에 전달된 다른 압력(곤충 핀의 압력 값이 보고되지 않음)의 차이 때문일 수 있다.
드로소필라 애벌레에 대한 기계적 고치 분석의 발달은 다른 기계적 감각 이온 채널과 신경 회로가 기계적 고치를 중재한다는 것을 발견 할 수 있게했다5,6,16,17. 그러나, 기계적 과민성(allodynia 및 hyperalgesia)의 연구는 다른 감각 양식의 민감화에 비해 지연되어7, 8,10,13,14,콜드9및화학3. 이러한 지연은 부분적으로 상류 임계값 압력에 이르는 전체 응답 범위를 생성할 수 있는 적합한 기계 프로브의 부재 때문일 수 있다. 특히 기계적 알로디니아를 평가하기 위한 중요한 것은, 부상하지 않은 애벌레에서 역경 압연 반응을 유도하지 않는 하위 임계값 프로브입니다. 우리의 개선 된 기계 프로브의 중요성은 무해한 자극 (하위 임계 값 ~ 174 kPa-200 kPa) 또는 낮은 에서 높은 유해 범위 (suprathreshold ~225 kPa ~ ~ ~ 5,116 kPa)에 걸쳐 조작 될 수 있다는 것입니다. 여기에서, 우리는 Drosophila 애벌레가 UV 조사 후에 기계적인 알로디니아 및 기계적인 hyperalgesia둘 다 발전하는 nitinol 폰 프레이 같은 필라멘트를 사용하여 보여줍니다. 기계적 감도는 열 감화에 비해 몇 가지 차이를 보여줍니다. 기계적 감작의 발병및 피크는 모두 열(열) 감점(초간증의 경우~8h, 알로디니아의 경우 ~24h)에 비해더일찍(~4h)이다. 또한, 기계적 알로디니아 및 과진증은 수반된다(둘 다 ~4h에서 최고). 더욱이, 열 감도(알로디니아 및 과발증)가 나중에 완전히 해결되는 동안7,기계적 과민성은 기준선 위에 약간 남아 있는 긴 꼬리를 나타냈다. Drosophila의 감기 감속제는 감기에 자극된 행동9의 스위치와 새로운 감기 유발 행동의 출현을 포함합니다 – 기계자극으로 관찰되지 않는 현상. 발병, 지속 시간 및 관찰된 동작에 있는 이 다름은 각 감각 양식이 다른 신호 통로에 의해 통제될 수 있다는 것을 건의합니다. Drosophila에서 사용할 수 있는 강력한 유전 공구와 여기에서 기술된 감작 분석체를 결합하는 것은 관찰된 기계과민성 (알로디니아 및 과질증)의 정확한 유전 해부를 허용해야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 프로토 타입 폰 프레이 필라멘트를 개발 토마스 왕, 기계 프로브 분석 개선을위한 패트릭 J. 황, 제어를위한 블루밍턴 드로소필라 주식 센터(w1118)및 ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP 비행 주식, 그리고 골코 실험실 구성원은 비판적으로 원고를 읽고. 이 작업은 R21NS087360 및 R35GM126929에서 MJG에 의해 지원되었습니다.
Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
Microscope Cover Glass 22×22 | Fisher | 12-545-B | |
Microscope Cover Glass 22×40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |