미생물 분자 서명을 사용하여 스트림에 유압 골절의 영향 평가

1. 핵산 추출을 위한 퇴적물 시료 의 수집 멸균 50mL 원콘튜브를 하천 물에 담급한다. 원치 않는 인간의 오염을 도입하지 않도록 샘플 수집 중에 장갑을 착용하십시오. 해안에서 또는 물 에서 상류를 향하고 중 하나를 수행합니다. 원문 튜브가 침수되는 동안 캡을 제거하고 원문 튜브에 1 ~ 3cm 깊이에서 약 3 mL의 퇴적물을 스쿱하는 데 사용합니다. 퇴적물 시료(약 1mL)를 덮는 얇은 층을 제외하고, 물에서 원물 튜브를 제거하고 모든 물을 덤프합니다. 1000 μL 파이펫과 적절한 파이펫 팁을 사용하여 수집된 샘플에 DNA/RNA 방부제 3mL(방부제 사양용 재료 표 참조)을 추가합니다. 파이펫 팁을 멸균 파이펫 팁 상자에 넣고 사용 후 폐기하기 직전에 만 부착하십시오. 방부제와 시료가 철저히 혼합되도록 캡된 원추형 튜브를 10번 반전시하십시오.참고 단계 1.4는 필요하지 않지만 RNA를 나중에 퇴적물에서 추출하는 경우 강력히 권장됩니다. 샘플 수집의 나머지 부분에 대한 얼음에 샘플을 배치합니다. 수집에서 반환하면, 샘플이 16S 분석 (DNA) 또는 -70 °C에 사용되는 경우 – 20 °C에서 냉동실에 저장, 그들은 형이상학 분석 (RNA)에 사용되는 경우. 2. 핵산 추출을 위한 필터 수집 멸균 1 L 병의 캡을 제거합니다. 상류 또는 해안에서 마주보고있는 동안, 상단에 스트림 물로 병을 채우고 그것을 덤프. 이 과정을 두 번 더 반복하여 병을 조절합니다. 전체 병을 네 번째로 채우고 캡을 씌웁니다.참고: 1L 병을 재사용하는 경우 2분 동안 10%의 표백제로 헹구고, 그 다음에는 탈이온화된 물로 3회 헹구고, 70%에탄올로 한 번 헹구고, 마지막으로 설정으로 자동 적으로 자동화할 수 있습니다: 121.1°C에서 30분 노출 시간 및 15분 건조 시간. 오토클레이브 하는 동안, 병의 캡은 프로세스에서 압축 되는 병을 피하기 위해 매우 느슨한 해야 합니다. 안정된 표면에 일단, 멸균 Luer 잠금 주사기를 사용하고 전체 볼륨을 그립니다. 그런 다음 주사기를 멸균 및 DNA/RNA가 없는 직경 1.7cm의 폴로테셔술폰 필터에 0.22 μm의 모공 크기로 연결하고 플런저를 끝까지 눌러 필터를 통해 전체 부피를 밀어 넣습니다. 병(1L)에서 수집된 총 부피가 필터를 통해 푸시될 때까지 이 과정을 반복한다.참고: 주사기의 부피는 필터를 통해 밀어붙이는 총 물의 양이 추적되는 경우 가변적일 수 있다. 그러나 일반적으로 60mL이 바람직하다. 1 L은 이상적이지만, 일화적으로, 적어도 200mL의 부피는 DNA와 RNA의 추출을 위해 충분한 바이오매스 (mL당 ~20,000 세포를 가정)를 수집 할 가능성이 높습니다. 약 20mL 상당의 공기를 주사기에 끌어서 필터를 통해 밀어필터에서 여분의 물을 제거합니다.참고: 2.4단계가 수행되면 방부제의 손실을 방지하는 데 도움이 됩니다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 필터를 수평으로 유지하면서 필터의 더 큰 개구부(주사기에 부착된 곳)를 통해 방부제의 2mL를 추가합니다. 파이펫이 방부제가 필터에 들어가는지 확인하기 위해 피펫이 우울할 때 파이펫의 끝은 필터의 배럴 내에 있어야 합니다. 각 사용 후 팁을 변경합니다.참고: 퇴적물 수집과 마찬가지로, 이 단계는 필요하지 않지만, 특히 RNA의 경우 나중에 핵산 수율을 높이는 데 강력히 권장됩니다. 파라핀 필름 의 한 사각형을 벗겨 밀봉 필터의 각 개구부 / 끝 주위에 단단히 포장. 파라핀 필름 포장 필터를 멸균 샘플 백에 넣은 다음 수집 중에 전체 가방을 얼음 위에 놓습니다.참고: 필터를 감싸는 데 사용되는 측면이 이전에 환경에 노출되지 않은 멸균되었는지 확인합니다. 샘플링에서 돌아오면 필터를 -20°C에서 16S 또는 메타 전사학용 -70°C에 저장합니다. 3. 핵산 추출 및 정량화 샘플 전송을 시작하기 전에 10 % 표백제와 70 %의 에탄올로 작업 영역을 청소하십시오. 퇴적물(1.5단계에서)의 경우 일반적으로 ~0.25 g의 시료를 사용하십시오. 화염은 70%의 에탄올비커에 담그고 샘플 사이에 에탄올을 태우는 것으로 금속 공구를 살균합니다. 필터(2.6단계에서)의 경우 필터 용지를 멸균 튜브로 이동하여 추출합니다. 이렇게하려면 아래 단계를 따르십시오. 접이식 의 내부 부분이 외부 환경에 노출되지 않도록 알루미늄 호일을 접고 접힌 조각을 설정으로 자동화하여 멸균, DNA 및 RNA 자유 표면을 만듭니다: 121.1°C 및 5분 건조 시간. 70% 에탄올과 화염으로 바이스 그립을 살균합니다. 그런 다음 바이스 그립을 사용하여 멸균 표면의 필터 케이스를 열고 케이스에서 코어를 제거합니다. 멸균 메스를 사용하여 필터 용지를 코어에서 잘라내고 위쪽과 아래쪽을 잘라낸 다음 솔기를 따라 잘라냅니다. 멸균 핀셋을 사용하여 필터 용지를 접은 다음 필터를 메스를 사용하여 작은 조각으로 자른다. 추출을 위해 미세 원심 분리기 튜브에 필터 조각을 놓습니다. 필터 용지가 살균되지 않거나 핵산이 존재할 수 있는 표면과 접촉하지 않는지 확인하십시오. 이전에 설명된 바와 같이 DNA절연을 수행 13 또는 상업적으로 사용 가능한 컬럼 기반 키트를 사용하여 (재료의 표참조). 나열된 상용 키트의 단계는 아래에 간략하게 설명되어 있습니다. 비드 튜브로 옮기고 적어도 5 분 동안 고속으로 세포 파괴기로 복종하여 샘플 내의 세포를 lyse. 원심분리기및 상피체를 멸균 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 상체(1:1 볼륨)에 용해 버퍼를 추가하고 제공된 필터(노란색)로 옮김합니다. 필터를 원심분리합니다. 필터를 새로운 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮기십시오. 준비 버퍼(400 μL), 원심분리기를 추가하고 흐름을 폐기합니다. 세척 버퍼(700 μL), 원심분리기를 추가하고 흐름을 폐기합니다. 그런 다음 세척 버퍼 (400 μL), 원심 분리기를 추가하고 흐름을 다시 폐기합니다. 필터를 새로운 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮기십시오. DNase/RNase 의 50 μL을 가진 엘ute는 원심분리하기 전에 실온에서 5 분 동안 앉게하십시오. 큐베이션 기간 동안, 수집 튜브에 배치하고 HRC 준비 용액(600 μL)을 추가하여 III-HRC 필터를 준비하고 8,000 x g에서3분의 원심 분리 단계를 수행한다. 준비된 필터를 멸균 미세 원심분리기 튜브로 이동합니다. 3.4.5 단계에서 이 필터및 원심분리기로 3분 동안 16,000 x g로 동경의 DNA를 전달합니다. 통해 흐름은 추출 된 DNA를 포함. -20°C에서 퇴적물 및 필터 모두에 대한 DNA 추출물을 저장합니다.참고: DNA 추출물은 안정적인 온도, 제한된 광 노출 및 유해한 오염물질(14)을가정하여 -20°C에서 약 8년 동안 보관할 수 있다. 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 절연을 수행합니다. RNA 추출물을 -80°C에 저장합니다. 비드 튜브로 옮기고 적어도 5 분 동안 고속으로 세포 파괴기로 복종하여 샘플 내의 세포를 lyse. 원심분리기및 상피체를 멸균 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 상체(1:1 볼륨)에 리시스 버퍼를 추가하고 제공된 열(노란색)으로 옮김합니다. 열을 원심분리합니다. 95-100% 에탄올의 동일한 볼륨을 흐름에 추가하고 5번 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 멸균 미세 원심 분리기 튜브에 IICG 컬럼(녹색)을 놓습니다. 혼합 솔루션을 컬럼 및 원심분리기로 전송합니다. 세척 버퍼(400 μL), 원심분리기를 추가하고 흐름을 폐기합니다. DNase I 5 μL과 75 μL의 DNA 소화 버퍼를 컬럼에 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 준비 버퍼(400 μL), 원심분리기를 추가하고 흐름을 폐기합니다. 세척 버퍼(700 μL), 원심분리기를 추가하고 흐름을 폐기합니다. 그런 다음 세척 버퍼 (400 μL), 원심 분리기를 추가하고 흐름을 다시 폐기합니다. 컬럼을 새로운 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮기습니다. DNase/RNase 의 50 μL을 가진 엘루테는 원심분리기 전에 5분 동안 앉게 하십시오. 그 인큐베이션 기간 동안, 수집 튜브에 배치하고 HRC 준비 솔루션 (600 μL)을 추가하여 III-HRC 필터를 준비하고 8,000 x g에서3 분의 원심 분리 단계를 수행합니다. 준비된 필터를 멸균 미세 원심분리기 튜브로 이동합니다. 3.6.9 단계에서 이 필터및 원심분리기로 3분 동안 16,000 x g로 동경 RNA를 전달한다. 관통하는 흐름에는 추출된 RNA가 포함되어 있습니다.참고: RNA 추출물은15의분해를 시작하기 전에 1년 동안만 저장할 수 있습니다. DNA와 RNA 추출물은 반복된 동결 해동에 의해 저하됩니다. 일부 프로토콜은 동일한샘플(16,17)에서DNA와 RNA를 모두 추출할 수 있도록허용한다. 발광계 또는 분광계를 사용하여 추출된 DNA 및 RNA 샘플을 정량화한다. 예를 들어 형광계 DNA 농도 값을 표 1을 참조하십시오. 예를 들어 분광계 정량화 프로토콜은 참조18을참조하십시오. 재료표에 기재된 키트를 가진 퇴적DNA 농도 값은 일반적으로 1 내지 40 ng/μL범위, 필터 DNA 농도 값은 0.5 내지 10 ng/μL. 재료표에 나열된 키트를 가진 퇴적 RNA 농도 값은 일반적으로 약 1 내지 20 ng/μL 범위, 필터 RNA 농도 값이 낮아지는 경향이 있는 동안, 일반적으로 0.5에서 5 ng/μL에 이르기까지 다양합니다. 4. 16S rRNA 라이브러리 생성 10% 표백제와 70% 에탄올로 작업 영역을 청소하십시오. 작업 영역은 라미나르 유량 조건(라미나르 플로우 후드)을 생성할 수 있는 밀폐된 공간이어야 합니다. DNA 추출물(3.5단계에서)을 사용하고, 라미나르 유량 조건 하에서 16S rRNA19의 V4 초변 영역을 증폭시키는 지구 미생물군유전체 의 웹 사이트에 설명된 것과 같은 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 16S rRNA 앰플리콘 염기서열분석용 샘플을 준비한다. 앞서 설명한 대로 2% 아가로즈 젤을 준비하고17을고화시키게 한다. PCR 제품의 7 μL과 DNase 프리 워터의 13 μL을 혼합합니다. 젤 로딩 염료를 1x의 최종 농도에 추가합니다. 아가로즈가 고화되면 이 PCR 제품을 2% 아가로즈 젤에 섞어 적재하십시오.참고: 또는, 이러한 젤이 더 빨리 실행되고 미리 만들어지기 때문에 미리 발주된 젤을 대신 사용할 수 있습니다. 60-90분 동안 90V에서 젤을 실행하여 지구 미생물군유전체의 프로토콜을 사용하여 16S rRNA V4 앰플리턴에 대한 성공적인 증폭으로 386의 대역 크기를 확인합니다. 5. DNA 16S rRNA 라이브러리 정화 적절한 크기의 멸균 미세 센심분리기 튜브에서 희미한 밴드를 산출한 시료에 대해 밝은 대역과 13 μL을 산출한 샘플용 PCR 제품의 풀 10 μL. 불소계 또는 분광계를 사용하여 결과 풀의 농도를 확인하고 이전과 같이 2 % 아가로즈 젤을 준비하십시오. 이상적으로, 수영장은 적어도 10 ng/μL의 농도가 있어야 하며, 대부분의 샘플은 약 25 ng/μL의 농도가 있어야 합니다. 농도 및 부피 허용, 2% 아가로즈 젤의 우물에 약 150-200 ng로드. 90볼트에서 60-90분 동안 젤을 실행합니다. 2% 아가로즈 젤을 실행하여 풀이 있는 라이브러리를 정화합니다. 겔에서 386 bp DNA 밴드를 소비하고 이전에 설명된 바와 같이 시판된 키트를 사용하여 풀라이브러리를정화한다. 10mM Tris-Cl(pH 8.5)의 30 μL로 정제된 DNA를 엘테. 젤을 절단하면 PCR 앰플리턴을 실험자 및 주변 지역에 확산시키기 때문에 DNA 또는 RNA 추출과는 다른 영역에서 이 단계를 수행하여 향후 오염을 방지합니다. 불소계 또는 분광계를 사용하여 정제 된 풀의 농도를 확인하십시오. 정화가 잘 되면, 그 농도는 순수하지 않은 수영장의 절반 이상이어야합니다. 일반적으로 최종 농도는 5~20ng/μL 범위여야 합니다. 다음 세대 시퀀싱을 위해 정제된 라이브러리를 보냅니다. 선적 컨테이너에 드라이 아이스를 포함시켜 운송 중에 차갑게 유지되도록 하십시오. 6. RNA 라이브러리 생성 및 정화 몇몇 상용 키트는 RNA 라이브러리를 만들기 위하여 이용될 수 있습니다. 어느 것이 든 사용되든 멸균 라미나르 흐름 환경에서 작업하는 동안 작성된 대로 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 재료 표의 키트에 대한 프로토콜의 매우 요약된 버전은21아래에 표시됩니다. 첫 번째 가닥 cDNA 합성 마스터 믹스(뉴클레아제없는 물의 8 μL 및 첫 번째 스트랜드 합성 Enyzme Mix의 2 μL)를 만들어 시료에 추가합니다. 프로토콜에 지정된 조건과 함께 샘플을 열순환기에 배치합니다. 얼음에 두 번째 가닥 cDNA 합성 마스터 믹스 (제 2 가닥 합성 반응 버퍼의 8 μL, 4 μL 두 번째 가닥 합성 효소 믹스, 뉴클레아제없는 물의 48 μL)를 만들어 샘플에 추가합니다. 1시간 동안 16°C로 설정된 열순환기에 놓습니다. 제공된 구슬(144 μL)을 추가하고 2개의 80% 에탄올 세세(200 μL)를 수행하여 반응을 정화합니다. 제공된 TE 버퍼(53 μL)를 엘ute하고 상체의 50 μL을 깨끗한 PCR 튜브로 옮기습니다. PCR 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 얼음에 최종 준비 마스터 믹스 (최종 준비 반응 버퍼의 7 μL 및 최종 준비 효소 믹스의 3 μL)를 확인하고 PCR 튜브에 추가합니다. 프로토콜에 지정된 조건과 함께 PCR 튜브를 열순환기에 배치합니다. 희석된 어댑터(2.5 μL), 리딩 마스터 믹스(30 μL) 및 리기션 인핸서(1 μL) 솔루션을 얼음에 섞습니다. 혼합 솔루션을 샘플에 추가하고 20°C에서 15분 동안 열순환기를 배치합니다. 제공된 구슬(87 μL)을 추가하고 에탄올 세세스(200 μL)를 수행하고 용출을 수행하여 반응을 정화하되, TE의 17μL만 추가한다. 인덱스(10 μL)와 Q5 마스터 믹스(25 μL) 용액을 추가하고 프로토콜에 설명된 조건이 있는 열순환기에 배치합니다. 제공된 구슬(45 μL)을 추가하고 2개의 에탄올 세세이션(200 μL)을 추가수행하고 TE의 23μL을 가진 엘루트를 추가하여 반응을 정화한다. 깨끗한 PCR 튜브에 20 μL을 전송합니다. 생체 분석기, 불소계 또는 분광계를 사용하여 RNA의 검출 가능한 농도에 대한 라이브러리를 확인하십시오. 메타전사 라이브러리를 대략 적인 비율로 풀. 250~400bp 사이의 절제 조각을 제외하고, 16S 라이브러리 정화에 대해 동일한 프로토콜에 따라 라이브러리를 정화한다. 16S 라이브러리에는 증폭 된 영역을 나타내는 뚜렷한 밴드가 있었지만, 여기에 결과는 얼룩입니다. 정수된 도서관의 농도를 이전과 같이 확인합니다. 정화된 도서관에 드라이 아이스를 시퀀싱 시설로 배송합니다.참고: 대안적으로, RNA 추출물은 도서관 준비 및 시퀀싱을 위해 대학 또는 민간 기업으로 보낼 수 있다. 7. 미생물 커뮤니티 분석 시퀀싱이 완료되면 샘플 데이터에 액세스합니다. 사용 가능한 컴퓨터에 다운로드합니다.참고: 이상적으로는 장치에 최소 16기가바이트의 RAM이 있어야 합니다. (Qiime2의 경우) 컴퓨팅 요구 사항에 대한 토론은 https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808 참조하십시오. 16S rRNA 데이터를 분석하기 위해 모들, QIIME2 및 R과 같은 소프트웨어를 사용합니다. 예를 들어 QIIME2 16S 분석 자습서를 보려면 여기 https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ 참조하십시오. 형이상학 (RNA) 데이터를 위해, HUMAnN2와 ATLAS를 사용하여 샘플에 존재하는 유전자와 경로를 결정합니다.참고: 다양성과 무작위 포리스트 분석의 절정을 이루는 메타전사 파이프라인이 보충 정보 파일에나와 있습니다. 모든 명령은 Mac 사용자를 위한 터미널과 같은 명령줄을 통해 실행됩니다.