Using Enclosed Y-Mazes to Assess Chemosensory Behavior in Reptiles

M. Rockwell Parker; Andrea  F. Currylow; Eric  A. Tillman; Charlotte  J. Robinson; Jillian  M. Josimovich; Isabella  M. G. Bukovich; Lauren  A. Nazarian; Melia  G. Nafus; Bryan  M. Kluever; Amy A. Yackel Adams

doi:10.3791/61858

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Verhalten

Verwendung geschlossener Y-Labyrinthe zur Beurteilung des chemosensorischen Verhaltens bei Reptilien

Published: April 07, 2021

doi:

10.3791/61858

M. Rockwell Parker*¹, Andrea F. Currylow*², Eric A. Tillman³, Charlotte J. Robinson², Jillian M. Josimovich², Isabella M. G. Bukovich¹, Lauren A. Nazarian¹, Melia G. Nafus⁴, Bryan M. Kluever³, Amy A. Yackel Adams⁴

¹Department of Biology,James Madison University, ²U.S. Geological Survey,Fort Collins Science Center, ³U.S. Department of Agriculture,National Wildlife Research Center, ⁴U.S. Geological Survey,Fort Collins Science Center

Summary

Y-Labyrinthe ermöglichen es Forschern, die Relevanz spezifischer Reize zu bestimmen, die das Verhalten von Tieren antreiben, insbesondere isolierte chemische Hinweise aus einer Vielzahl von Quellen. Sorgfältiges Design und Planung können robuste Daten liefern (z. B. Diskriminierung, Erkundungsgrad, zahlreiche Verhaltensweisen). Dieser experimentelle Apparat kann starke Einblicke in Verhaltens- und ökologische Fragen geben.

Abstract

Reptilien nutzen eine Vielzahl von Umwelthinweisen, um das Verhalten von Tieren zu informieren und zu steuern, z. B. chemische Duftspuren, die von Lebensmitteln oder Artgenossen erzeugt werden. Die Entschlüsselung des geruchsverwandten Verhaltens von Wirbeltieren, insbesondere invasiven Arten, ermöglicht die Entdeckung von Hinweisen, die ein erkundungsorientiertes Verhalten induzieren und bei der Entwicklung wertvoller grundlegender und angewandter biologischer Werkzeuge helfen können. Es kann jedoch schwierig sein, Verhaltensweisen zu bestimmen, die dominant von chemischen Hinweisen im Vergleich zu anderen konkurrierenden Umwelthinweisen bestimmt werden. Y-Labyrinthe sind gängige Werkzeuge, die in der Tierverhaltensforschung verwendet werden und die Quantifizierung des chemosensorischen Verhaltens von Wirbeltieren über eine Reihe von Taxa hinweg ermöglichen. Durch die Reduzierung äußerer Reize entfernen Y-Labyrinthe Störfaktoren und präsentieren Fokustieren eine binäre Wahl. In unseren Y-Labyrinth-Studien ist ein duftendes Tier auf einen Arm des Labyrinths beschränkt, um eine Duftspur zu hinterlassen, und wird entfernt, sobald die Geruchslegendenparameter erfüllt sind. Dann wird je nach Versuchstyp entweder das Brenntier in das Labyrinth gelassen oder es wird eine konkurrierende Duftspur erstellt. Das Ergebnis ist eine Aufzeichnung der Wahl und des Verhaltens des Fokustieres, während zwischen den präsentierten chemischen Hinweisen unterschieden wird. Hier werden zwei Y-Labyrinth-Apparate beschrieben, die auf verschiedene invasive Reptilienarten zugeschnitten sind: Argentinische schwarze und weiße Tegu-Eidechsen (Salvator merianae) und burmesische Pythons (Pythonbivittatus) , die den Betrieb und die Reinigung dieser Y-Labyrinthe skizzieren. Darüber hinaus wurden die Vielfalt der produzierten Daten, experimentelle Nachteile und Lösungen sowie vorgeschlagene Datenanalyse-Frameworks zusammengefasst.

Introduction

Y-Labyrinthe sind gängige, einfache Werkzeuge in Studien zum Verhalten von Tieren, die es ermöglichen, eine Vielzahl von Fragen zu beantworten. Y-Labyrinthe werden nicht nur häufig in Laborstudien eingesetzt, sondern sind auch funktional mit verschiedenen Feldumgebungen kompatibel, um wilde Tiere in relativ abgelegenen Umgebungen zu untersuchen. Forscher haben das Verhalten von wilden Wirbeltieren mit Y-Labyrinthen in einer Vielzahl von Taxa in ähnlich unterschiedlichen Feldanwendungen untersucht (z. B. Neunaugen¹; Buntbarsch²; Giftfrösche³; Lacertid-Eidechsen⁴; Strumpfbandnattern⁵).

Viele Forscher konzentrieren sich darauf, wie und in welchem Ausmaß chemische Hinweise das Verhalten von Tieren in der Fortpflanzungs-, Raum- und Nahrungsökologie beeinflussen⁶. Eine Vielzahl chemischer Reize kann in Y-Labyrinthen und auf feinen Skalen getestet werden, wie z.B. zwei chemische Spuren, die sich in Konzentration⁷nur geringfügig unterscheiden, oder die Nachweisfähigkeit basierend auf dem Fortpflanzungsstatus der Zielart⁸. Chemische Spuren – der Hauptreiz, der in Y-Labyrinth-Tests verwendet wird – können auf natürliche Weise von Artgenossen erzeugt oder von einem Forscher mit einer definierten chemischen Quelle spezifisch in die Umwelt gebracht werden¹^,⁵. Stimuli können auch in einzigartigen Kombinationen getestet werden, um den multimodalen Einfluss von Cues zu bestimmen, z. B. wechselnde Kontexte der Cue-Präsentation (airborne vs. Substrate trails^9;visual plus chemical cues¹⁰). Obwohl es viele andere Methoden zur Beurteilung chemosensorischer Reaktionen bei Reptilien gibt (siehe Diskussionsabschnitt), ermöglichen Y-Labyrinthe die Beurteilung von Suchverhalten(n) auf mehreren zeitlichen und räumlichen Skalen, was zu einer höheren Verhaltensinferenz führen kann.

Reptilien wurden weitgehend auf ihre Abhängigkeit von chemischen Hinweisen in der Fortpflanzungs- und Nahrungsökologie getestet, und Forscher verwenden in diesen Studien oft Y-Labyrinthe¹¹^,¹². Die chemische Ökologie von Reptilien wird weiterhin durch Studien entschlüsselt, die Y-Labyrinthe verwenden, um eine Vielzahl von evolutionären und Verhaltensfragen zu beantworten, die für Wildtiermanager wertvoll sind. Zum Beispiel haben jüngste Tests mit invasiven Schlangen- und Eidechsenarten gezeigt, dass chemische Hinweise allein die Wahl und Zeitzuweisung innerhalb der neuartigen Umgebung eines Y-Labyrinths beeinflussen können¹³^,¹⁴^,¹⁵.

Die Verwendung großer Y-Labyrinthe für mittelgroße fokale Tiere (z. B. großwüchsige Reptilien) ist im Allgemeinen auf Laborumgebungen beschränkt, in denen die fokalen Tiere langfristig leicht untergebracht werden können, experimentelle Faktoren (z. B. Klima, Licht, äußere Reize) kontrolliert werden können und der Zugang zu Infrastruktur (z. B. Strom, fließendes Wasser) unbegrenzt ist. Studien an Wildtieren sind jedoch aus verschiedenen Gründen (z.B. Logistik, Genehmigung) oft auf bestimmte Standorte beschränkt. Daraus ergeben sich Herausforderungen, die durch kreative Problemlösungen und methodische Anpassungen angegangen werden müssen, um konsistente und vergleichbare Ergebnisse zu erhalten.

Hier wurden zwei Versuchsaufbauten mit Y-Labyrinthen und Fernüberwachungswerkzeugen beschrieben, um die reproduktive chemische Ökologie invasiver Squamat-Reptilien (d.h. Schlangen und Eidechsen) in verschiedenen Feldszenarien zu bewerten: wild gefangene, in Gefangenschaft gehaltene argentinische schwarze und weiße Tegu-Eidechsen (Salvator merianae) in Gainesville, FL, und wild gefangene burmesische Pythons (Python bivittatus) im Everglades National Park, FL. Wie der Name schon sagt, schafft der Y-Labyrinth-Apparat eine experimentelle Umgebung, in der ein Tier in einen Hauptgang (die Basis des Y; “Basis”), die dann zu zwei divergierenden Durchgängen führt (die Arme des Y; “Waffen”). In diesen Experimenten werden zwei Arten von Tieren für einen einzigen Versuch verwendet: duftende Tiere (liefern den Reizduft in einem begrenzten Bereich des Labyrinths) und Fokustiere (Daten werden über dieses Tier gesammelt, während es die Duftspur erforscht).

Als Versuchsapparat in chemoökologischen Studien muss jedes Y-Labyrinth so konstruiert sein, dass es eine einfache Entfernung des Tieres im Inneren ermöglicht und zur gründlichen Reinigung und Rücksetzung zerlegt werden kann. Diskutiert werden auch die Einschränkungen, die diesen verschiedenen Testumgebungen innewohnen (z. B. tagaktive vs. nachtaktive Tiere, Infrastrukturunterschiede), die zu methodischen Anpassungen führten. Obwohl der Fokus auf Tegu-Eidechsen und burmesischen Pythons lag, können diese Designs auf eine Vielzahl von Reptilienarten angewendet werden. In dieser Forschung an invasiven Reptilien profitieren Y-Labyrinthe von der Rate und dem Umfang der Inferenz, da sie eine schnelle Sammlung von Daten ermöglichen, um Managementziele zu erreichen, die sich mit der Invasionsbedrohung durch eine bestimmte Art im Einklang bewegen. Insbesondere das Studium der Chemoökologie invasiver Arten ist entscheidend für die Entwicklung wirksamer chemischer Kontrollinstrumente.

Diskriminierung ist die Schlüsselbeobachtung aus empirischen Tests mit Y-Labyrinthen, in denen ein fokussierendes Tier zwischen zwei Reizen wählt und der Entscheidungsprozess bewertet wird. Eine Reihe von Verhaltensweisen kann auch in Y-Labyrinth-Versuchen während der Studie selbst (live) oder nach der Studie (Video) bewertet werden, um die Inferenzkraft zu erweitern. Die Komplexität der a priori Ziele einer bestimmten Studie bestimmt, ob Live-Beobachtung oder archivierte Aufnahmen am besten zum Design passen. Hier wurden Y-Labyrinth-Methoden zur Beantwortung chemoökologischer Fragen detailliert beschrieben, um zukünftige Studien von Forschern zu informieren, die sich für ähnliche Fragen zum Verhalten von Reptilien, insbesondere in der chemischen Ökologie, interessieren.

Protocol

Alle Verfahren, die den Einsatz lebender Wirbeltiere beinhalten, wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees des US-Landwirtschaftsministeriums und des U.S. Geological Survey genehmigt. HINWEIS: Da sich diese Studien auf invasive Wirbeltiere konzentrieren, müssen auch die Eindämmungsstandards eingehalten werden, die spezifische Einschränkungen für die Planung und Durchführung von Experimenten auferlegen. Obwohl viele der Methoden zwischen den beiden Studienorten und dem täglichen vs. nächtlichen Studienzeitpunkt ähnlich sind, wurden in jedem der folgenden beiden Abschnitte unterschiedliche Methoden beschrieben. 1. Y-Labyrinth-Setup und Tagurnalprotokoll für den Animal Plant Health Inspection Service (APHIS) des US-Landwirtschaftsministeriums (USDA) Wildlife Services National Wildlife Research Center Florida Field Station: Vor-Ort-Tests von wild gefangenem Tegus in Gefangenschaft HINWEIS: Pläne für alle Komponenten des Y-Labyrinths und der Containment-Struktur sind in Ergänzungsdatei 1enthalten. Abmessungen und Design des Y-Labyrinths Verwenden Sie ein Bodenstück (1,22 m x 2,44 m Faserzementverkleidungen), um das Y-Labyrinth zu verankern. Bohren Sie Löcher in die oberste Schicht, damit schlittenbolzen für die Befestigung der Labyrinthstücke nach oben passieren können. Spezifische Anweisungen finden Sie unter Zusatzdatei 1. Konstruieren Sie die Wände des Labyrinths aus weißer PVC-Verkleidungsplatte; Innenmaße des Sockels sind 120 cm L (Seitenwände) x 42 cm B x 14 cm H.HINWEIS: Die Breite des Durchgangs wurde für 2x Brennweite des Tieres ausgelegt. Die zusätzliche Breite ermöglicht die Flexibilität für zwei, von Tieren abgelagerte Duftspuren. Achten Sie darauf, dass die Innenmaße der Arme 120 cm L (Seitenwände) x 40 cm B x 14 cm H betragen. Stellen Sie das Labyrinth mit separaten unteren, seitlichen und oberen Komponenten zusammen, bevor Sie eine Testversion ausführen. Machen Sie die Oberseite aus klarem Acryl, um die Visualisierung von Tieren im Labyrinth zu ermöglichen. Spezifische Anweisungen finden Sie unter Zusatzdatei 1. Wenn eine einzelne Duftspur erstellt wird, verwenden Sie eine interne Trennwand in der Basis, um den Zugang zum Raum für den duftlegenden Tegu einzuschränken. Spezifische Anweisungen finden Sie unter Zusatzdatei 1. Wenn zwei Duftspuren von verschiedenen Tieren nacheinander abgelagert werden, verwenden Sie ein System von Trennwänden, um abwechselnde Arme des Labyrinths zu blockieren und jedes Tier von abwechselnden Hälften der Basis auszuschließen. Spezifische Anweisungen finden Sie unter Zusatzdatei 1. Verwenden Sie Boxen, um den Transport und die Sammlung von Tieren zu ermöglichen, die in Y-Labyrinth-Versuchen verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass alle Boxen undurchsichtig sind und mit abnehmbaren Deckeln und Acryltüren ausgestattet sind, die leicht gesichert werden können. Stellen Sie sicher, dass sich die Basisbox (109 cm L x 56 cm B x 46 cm H) an der Öffnung der Basis des Y-Labyrinths befindet. Verwenden Sie es, um duftende oder brennende Tiere in das Labyrinth zu übertragen und sich zu akklimatisiert, bevor Sie die Tür öffnen und den Tieren den freiwilligen Zugang zum Labyrinth ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass sich die Armboxen (83 cm L x 50 cm B x 44 cm H) an den Endenden der Arme des Y-Labyrinths befinden, um das Einfangen von duftenden oder brennenden Tieren zu erleichtern. Spezifische Anweisungen zu Konstruktion und Montage finden Sie unter Ergänzende Datei 1. Kamera-Setup für die tagaktive Videoaufnahme Kameraspezifikationen: Stellen Sie sicher, dass Projektkameras kontinuierliches Video unter variablen Lichtverhältnissen aufnehmen können und für den Außeneinsatz unter vorherrschenden Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen geeignet sind. Wenn die Kamera an der Unterseite des Studiengehäuses montiert ist, stellen Sie sicher, dass das gesamte Y-Labyrinth im Sichtfeld der Kamera erfasst werden kann. Passen Sie das Objektiv oder die Höhe der Kamera an, um das Sichtfeld zu vergrößern oder zu verringern. Wenn das Sichtfeld eingestellt ist, stellen Sie sicher, dass ausreichende Verhaltensdetails, wie z. B. Zungenbewegungen, erfasst werden können.HINWEIS: Wenn die Höhe des Studiengehäuses fest ist (z. B. 180 cm H), wodurch die Anpassung des Sichtfelds eingeschränkt wird, können mehrere Kameras verwendet werden, um eine vollständige Abdeckung des Y-Labyrinth-Innenraums zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Kameras so eingestellt sind, dass sie bei der Verwendung in Außenanwendungen einen “großen Dynamikbereich” aktivieren. Leistungsspezifikationen: Stellen Sie sicher, dass jede Kamera über eine ausreichende Stromversorgung verfügt, um für die Dauer des geplanten Versuchs kontinuierliche Videos aufzunehmen (z. B. verwenden Sie eine unterbrechungsfreie Stromversorgung (USV) mit einer integrierten Backup-Batterie, um eine kontinuierliche Stromversorgung zu gewährleisten).HINWEIS: Wenn kein Netzteil verfügbar ist, können POE-Kameras (Power over Ethernet) über Netzwerkkabel mit Strom versorgt werden, die an einen digitalen Videorecorder (DVR) oder POE-Switch angeschlossen sind, an dem ein Netzwerkvideorecorder (NVR) verwendet wird. Aufzeichnungsspezifikationen: Stellen Sie bei der Auswahl eines DVR oder NVR sicher, dass er die Projektanforderungen erfüllt, einschließlich ausreichender Speicherkapazität und genügend POE-Anschlüssen (DVR) oder Kamerakanälen (NVR), um die Anzahl der verwendeten Kameras aufzunehmen. Wählen Sie die Aufnahmeparameter entsprechend der gewünschten Videoqualität unter Berücksichtigung der Größe der Datendateien aus (z. B. H264-Komprimierungsrate und eine Bildrate von 10 Bildern pro Sekunde [FPS]). Protokoll zum Abrufen und Verarbeiten von Videos: Beginnen Sie mit der Aufnahme des Videos von dem Moment an, in dem das Tier beginnt, das Labyrinth zu betreten, bis zum Moment der Aufnahme oder des voreingestellten Zeitrahmens (1.3.3.4). Mit Software, die auf einem oder mehreren Computern installiert werden kann und die Anzeige von Live- oder aufgezeichneten Videos ermöglicht, exportieren Sie Dateien mit dem Videoformat Ihrer Wahl. Stellen Sie sicher, dass Sie für jede verwendete Kamera das gleiche Zeitfenster und die gleiche Videodauer exportieren, um die gleichzeitige Überprüfung mehrerer Feeds zu ermöglichen. Achten Sie darauf, die Daten regelmäßig zu exportieren, da viele Systeme ältere Daten mit neuen Daten überschreiben, wenn die SPEICHERKAPAZITÄT VON DVR/NVR-Dateien begrenzt ist. Protokoll für den Betrieb von DufttierenBewertung der Verzerrung Bevor Sie experimentelle Versuche durchführen, bewerten Sie ein Y-Labyrinth auf Verzerrung, indem Sie das Labyrinth wie unten beschrieben zusammensetzen, ohne jedoch den Duft auf dem Papier zu präsentieren. Akklimatisieren Sie das Fokustier und starten Sie den Versuch.HINWEIS: Abhängig vom Design der Studie (z. B. wiederholte Messungen mit den gleichen fokalen Tieren vs. Tests an neuartigen fokalen Tieren jedes Mal) werden Bias-Studien feststellen, dass das Labyrinth selbst die Wahl eines fokalen Tieres nicht verzerrt. Viele Faktoren tragen zu Verzerrungen bei, wie z. B. Höhe, Sonnenlicht und visuelle Marker. Wenn die Neuausrichtung oder Anpassung anderer physikalischer Aspekte des Labyrinths die Seitenverzerrung nicht beseitigt, randomisieren Sie den Arm, der in einer bestimmten Studie einen experimentellen Duft erhalten soll.HINWEIS: Über eine bestimmte Anzahl von Versuchen ergibt ein unvoreingenommenes Labyrinth eine Auswahlwahrscheinlichkeit von 0,5 für beide Arme, und es wird ein Binomialtest durchgeführt (Abbildung 2). Versuchsvorbereitung und Y-Labyrinth-Montage Tragen Sie beim Umgang mit Oberflächen, die das Tier erkunden kann, durchgehend Nitrilhandschuhe, um eine Geruchskontamination zu vermeiden. Wechseln Sie die Handschuhe zwischen den Versuchen und innerhalb der Einrichtung eines Versuchs, wenn mehrere Duftspuren erstellt werden. Bereiten Sie neues, sauberes Duftpapier (weißes Metzgerpapier, mindestens 61 cm breit) auf einer sauberen Oberfläche vor. Schneiden Sie auf eine angemessene Länge, so dass sich das Papier für jeden Abschnitt an der Kreuzung des Y überlappen und über die Enden der Basis und die Arme hinausragen kann, um unter die Boxen zu passen. Streichen Sie den Boden des Labyrinths und bedecken Sie dann entweder direkt mit Papier oder mit einer Grenzschicht zwischen Papier und Boden (z. B. Plastikfolie), um die Reinigung zu erleichtern, wenn das Tier defäkiert oder Moschus im Labyrinth ist. Befestigen Sie das Papier an Ort und Stelle, indem Sie es mit Schlittenbolzen im Boden durchbohren und von einem Ende zum anderen arbeiten, um die Oberfläche glatt zu halten. Überlappen Sie die Papiere an der Kreuzung, so dass sich das Basispapier oben befindet. Platzieren Sie die Seiten des Labyrinths über den Schlittenschrauben, aber befestigen Sie sie nicht am Boden. Setzen Sie die Partition(en) ein, die für den zu testenden Versuchstyp erforderlich sind, und sichern Sie sie (siehe Einzelduft 1.3.3 vs. Doppelduftversuche 1.3.4). Schieben Sie die Acryl-Oberteile in Schlitze und befestige sie mit flachen Kopfnägeln. Befestigen Sie die Seiten am Boden, indem Sie die Flügelmuttern an den Schlittenschrauben festziehen. Setzen Sie die sauberen Armboxen ein und befestigen Sie sie mit Rändelschrauben. Befestiges den Deckel der Box mit Kabelbindern. Stellen Sie sicher, dass die Türen entfernt wurden. EinzelduftversucheHINWEIS: Der Zweck dieser Versuche besteht darin, eine einzige Duftspur im Y-Labyrinth zu präsentieren, die von der Basis durch einen Arm verläuft. Bevor Sie die Acrylplatte montieren, befestige die Trennwand, um den unbehandelten Arm zu blockieren. Wählen Sie den duftenden Arm zufällig aus (z. B. Münzwurf, Zufallszahlengenerator). Legen Sie das duftende Tier in die saubere, trockene Bodenbox. Befestigen Sie den Deckel der Basisbox (z.B. Kabelbinder, Bolzen) und die Tür (z.B. Rändelschraube). Transportieren Sie die Haltebox zum Studiengehäuse und befestigen Sie sie mit Rändelschrauben am Ende der Basis des Y-Labyrinths.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Tür zur Basisbox vor dem Laden des Tieres vorhanden ist. Akklimatisieren Sie das Tier in der Box für einen festgelegten, konsistenten Zeitraum (z. B. 60 min). Entfernen Sie die Tür des Basiskastens und lassen Sie das Tier das Labyrinth frei betreten. Überwachen Sie die Tieraktivität aus der Ferne mithilfe von Video-Feed (siehe unten). Nachdem das Tier von der Basisbox zur Armbox gereist ist, entfernen Sie das Tier aus dem Labyrinth, da die Beduftung abgeschlossen ist. Wenn sich das Tier in einer Box befindet, setzen Sie die abnehmbare Tür ein und sichern Sie sie, entfernen Sie die Box und bringen Sie das Tier in sein Gehege zurück. Wenn sich das Tier wieder im Labyrinth befindet, warten Sie in der Nähe des Labyrinths, bis das Tier zur Box zurückkehrt, und entfernen Sie dann die Box.HINWEIS: Squamates defäkieren defensiv und erzeugen Alarmsignale, die den zu testenden Duft kontaminieren, also vermeiden Sie es, das Tier zu erschrecken. Wenn das Tier nicht in eine Box zurückkehrt, nähern Sie sich langsam dem Labyrinth und verwenden Sie visuelle Hinweise (z. B. langsames Händewinken), um das Tier in die Box zu ermutigen, und entfernen Sie dann die Box. Reinigen und trocknen Sie die Basisbox (1.5.5). Wenn eine Defäkation aufgetreten ist, sammeln und absorbieren Sie so viel wie möglich mit einem Papiertuch, aber wischen Sie nicht ab, um eine Ausbreitung zu verhindern. Zerlegen Sie das Labyrinth teilweise, um die innere Trennwand zu entfernen, und stellen Sie es dann wieder zusammen. Reinigen Sie die Partition (1.5.5). Fahren Sie mit Abschnitt 1.4 fort, um das Protokoll für das Ausführen von Brenntieren zu finden. DoppelduftversucheHINWEIS: Der Zweck dieser Versuche ist es, zwei verschiedene Duftspuren gleichzeitig im Y-Labyrinth zu präsentieren, wobei beide von der Basis durch ihren jeweiligen, zufällig ausgewählten Arm verlaufen. Bevor Sie die Acrylplatte montieren, befestigen Sie die Trennwände, um den Arm zu blockieren, der nicht für den ersten Duft ausgewählt wurde, und die Hälfte der Basis gegenüber dem blockierten Arm. Befolgen Sie die oben beschriebenen Verfahren für eine einzelne Duftversuchsstudie (1.3.3 bis 1.3.3.8) mit einer Ausnahme. Wenn die Acryltür entfernt wird (1.3.3.3), führen Sie eine halbgroße Tür in die Öffnung an der Seite ein, die blockiert bleiben soll, um sicherzustellen, dass sich das duftende Tier nur im offenen Teil des Labyrinths bewegen kann. Zerlegen Sie das Labyrinth teilweise, entfernen Sie die Trennwände und reinigen Sie (1.5.5). Trocken mit sauberen Handtüchern. Installieren Sie die Partitionen neu, aber drehen Sie sie um, um den jetzt duftenden Bereich des Labyrinths zu blockieren. Setzen Sie die Acrylplatte wieder ein. Wiederholen Sie Schritt 1.3.4.2 für das zweite duftende Tier. Zerlegen Sie das Labyrinth teilweise und entfernen Sie die Trennwände. Stellen Sie das Labyrinth wieder zusammen. Fahren Sie mit Abschnitt 1.4 fort, um das Protokoll für das Ausführen von Brenntieren zu finden. Protokoll für das Laufen von Fokaltieren während der Tagstunden Führen Sie die Schritte 1.3.3.2 bis 1.3.3.3 aus, wobei das fokale Tier für diese Studie geplant ist. Überwachen Sie die Tieraktivität aus der Ferne mithilfe von Video. Wenn Sie über ein festgelegtes Zeitfenster beobachten, starten Sie den Timer, wenn das Tier vollständig aus dem Basiskasten aufgetaucht ist. Nach Abschluss der Prüfung das Tier entfernen (1.3.3.4). Panne und Aufräumarbeiten Lösen Sie die restlichen Kisten aus dem Labyrinth und zerlegen Sie alle Kisten. Tragen Sie während der Demontage und Reinigung frische Nitrilhandschuhe. Entfernen Sie die Acryl-Oberteile und legen Sie sie zur Reinigung an einem sicheren Ort beiseite, um Kratzer oder Risse zu vermeiden. Achten Sie darauf, Kratzer beim Entfernen zu vermeiden (freies Sichtfeld für videoüberwachendes Verhalten muss beibehalten werden). Zerlegen Sie die Seiten des Labyrinths und legen Sie sie zur Reinigung beiseite.HINWEIS: Minimieren Sie Kratzer und UV-Abbau bei Y-Labyrinth-Materialien, indem Sie sie immer schattieren. Entfernen Sie das Papier (und den Kunststoff) in einer gleichmäßigen Bewegung, indem Sie es aufrollen, um eine Kontamination des Bodens zu vermeiden und es zu entsorgen. Verwenden Sie eine geruchlose Seife in Laborqualität und eine weiche Peelingbürste oder Mikrofasertücher, um alle Oberflächen der Y-Labyrinth-Stücke und alle Boxen zu reinigen. Reinigen Sie die Acryl-Oberteile und abnehmbaren Türen mit der gleichen Seife, aber mit weichen Schwamm- oder Mikrofasertüchern, um Kratzer zu vermeiden.HINWEIS: Die bekannten chemischen Signale in Squamat-Reptilien sind fettlösliche Verbindungen, und das Waschen mit einem Reinigungsmittel ist das Standardprotokoll zur Reinigung von Lipidhinweisen und anderen Gerüchen aus polymerbasierten Apparaten in terrestrischen Wirbeltierstudien11,12,21.HINWEIS: In Feldanwendungen können Hygieneprotokolle erforderlich sein. Wenn ja, besprühen Sie alle inneren Oberflächen des Labyrinths (Boden, Wände, Trennwände, Acrylstücke, Boxen) mit einer geeigneten Hygienelösung, lassen Sie es für 10 Minuten sitzen und wischen Sie es dann mit einem Mikrofasertuch ab. Spülen Sie die gereinigten Komponenten mit Wasser ab, indem Sie die Oberflächen mit sauberen, nassen Mikrofasertüchern abwischen, und vermeiden Sie, dass Seifenrückstände vor dem Spülen trocknen. Gießen Sie kein Wasser in das Labyrinth. Lassen Sie die Stücke an der Luft trocknen oder tupfen Sie sie mit frischen Mikrofasertüchern trocken. Nach dem Trocknen setzen Sie die Labyrinthteile wieder zusammen, wenn Sie sofort einen weiteren Versuch durchführen. 2. Y-Labyrinth-Setup und crepuscular Timing-Protokoll für die Versuche des U.S. Geological Survey (USGS) in Zusammenarbeit mit dem National Park Service: relativ abgelegene Tests von wild gefangenen burmesischen Pythons HINWEIS:Pläne für alle Komponenten des Y-Labyrinths und der Containment-Struktur sind in Supplemental File 2enthalten. Y-Labyrinth-Komponenten und Begründung für Änderungen am USDA-DesignHINWEIS: Das beschriebene Y-Labyrinth wurde signifikant verändert, um potenzielle Forschungsarten und isolierte Bedingungen zu erweitern. Die vertikale Tiefe wurde erhöht, um eine Vielzahl von Arten aufzunehmen, und verschiedene Materialien und Konstruktionsmethoden wurden verwendet, um die Haltbarkeit und Reinigung im Freien zu verbessern. Eine Visualisierung des fertigen Labyrinths finden Sie in Abbildung 1. Spezifische Anweisungen zu Konstruktion und Montage finden Sie unter Zusatzdatei 2. Schneiden Sie Y-Labyrinth-Komponenten aus weißem Polypropylen und schweißen Sie alle geschnittenen Teile, die dauerhaft fixiert werden sollen (z. B. Labyrinthboden und Seitenwände), mit Wärmeschweißen. Verankern Sie den Boden des Y-Labyrinths (244 cm L x 122 cm B) aus Sperrholzblechen, die mit Deckschrauben befestigt sind, und befestigen Sie ihn über eine Aluminium-Winkelhalterung, die an der Unterseite der äußeren Seitenwände des Labyrinths genietet ist. Stellen Sie sicher, dass die Basis des Y-Labyrinths 120 cm L x 42 cm B x 23 cm H beträgt und dass jede äußere Armseitenwand 120 cm L, die innere Armseitenwand 108 cm L ist (für spezifische Richtungen siehe Ergänzungsdatei 2). Schlitzen Sie die Acrylplatte mit einem Aluminiumwinkel ein, der alle 30 cm mit Schrauben an den Seitenwänden befestigt ist (für spezifische Anweisungen siehe Zusatzdatei 2).HINWEIS: Schrauben, die in regelmäßigen Abständen an der Oberkante der Y-Labyrinth-Seitenwände platziert werden, dienen auch als statische visuelle Markierungen bei der Analyse des Videos aus den Versuchen und liefern Maßstab. Stellen Sie sicher, dass jede Öffnung des Y-Labyrinths (Basis, Arme) eine zusätzliche Grundplatte (42 cm B x 30 cm H) am Ende der Seitenwand hat, die an einer Box befestigt ist, so dass die Grundplatte eine zentrale Öffnung einrahmt (34 cm B x 16 cm H; für spezifische Anweisungen siehe Zusatzdatei 2). Verwenden Sie ein Trennwandstück, um den Zugriff des duftenden Tieres einzuschränken (für spezifische Anweisungen siehe Zusatzdatei 2). Befestigen Sie eine Blockierplatte (46 cm B x 22 cm H) mit Befestigungsband. Verankerung der Trennwand und der Platte mit improvisierten, leicht zu reinigenden Gewichten (z. B. mit Wasser gefüllte Kunststoffkanne; 2.3.6; Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die Acrylstücke die Oberseite des Labyrinths bilden (0,6 cm dick, klar). Spezifische Anweisungen finden Sie unter Zusatzdatei 2. Verwenden Sie undurchsichtige Boxen, die mit einer Schiebetür und Deckeln ausgestattet sind, die leicht gesichert werden können, um den Transport und die Sammlung von Tieren in Y-Labyrinth-Versuchen zu ermöglichen (Abbildung 1). Modifizieren Sie die Boxen (21,6 cm L x 27,9 cm W) mit Abflusslöchern im Boden, montieren Sie die Deckel mit kleinen Schrauben und Muttern und bieten Sie eine einzige Öffnung für den Ein- / Austritt (die Tür). Spezifische Anweisungen finden Sie unter Zusatzdatei 2. Befestigen Sie die Box am Ende des Y-Labyrinths, indem Sie die Box-Frontplatte mit Schrauben und Flügelmuttern oder Schlössern an der Y-Maze-Frontplatte befestigen.HINWEIS: Wenn sie an Ort und Stelle sind, verankern boxen auch die Acryl-Oberteile an Ort und Stelle. Kamera-Setup für crepuskuläre Videoaufnahme: Siehe Abbildung 1 für eine Momentaufnahme des Kamera-Sichtfelds. Kameraspezifikationen: Stellen Sie sicher, dass die Projektkamera kontinuierliches Video unter variablen Licht- und Temperaturbedingungen aufnehmen kann, um krepuskuläre und nachtaktive Studienarten aufzunehmen. Mit der Projektkamera, die an den Deckenquerträgern des Gehäuses montiert ist, stellen Sie sicher, dass das gesamte Y-Labyrinth im Sichtfeld der Kamera erfasst werden kann. Erhöhen oder senken Sie die Höhe des Zeltes, um das Sichtfeld zu vergrößern oder zu verringern (Projektkamera in einer Höhe von ~3 m montiert). Stellen Sie sicher, dass die Reflexion des von der Kamera auf der Acrylplatte emittierten Infrarotlichts kritische Teile der Bilder in den Nachtaufnahmen nicht verdeckt. Leistungsspezifikationen: Stellen Sie sicher, dass jede Projektkamera über eine ausreichende Stromversorgung verfügt, um kontinuierliche Videos für Die Aufnahme von Videos über Nacht (ca. 20 h) aufzunehmen.HINWEIS: Wenn kein Wechselstromversorgung verfügbar ist, kann die Stromversorgung mit tief im Zyklus versiegelten Blei-Säure-12-Volt-Batterien (z. B. zwei parallel verdrahtete 12-V-20-Ah-Gelbatterien) erfolgen. Aufnahmespezifikationen: Um das Dateispeichervolumen zu minimieren, zeichnen Sie videos mit der niedrigsten Qualität auf, die noch ausreicht, um das Zählen von Zungenbewegungen im Y-Labyrinth zu ermöglichen.HINWEIS: Hochauflösendes Filmmaterial erfordert ein großes Speichervolumen, und das Verringern der Auflösung ist eine sehr effektive Möglichkeit, um sicherzustellen, dass die Dateigrößen überschaubar sind. Begrenzen Sie die Framerate (Bilder pro Sekunde, FPS) des Filmmaterials auf das Minimum, das zur Erkennung von Zungenstreifen erforderlich ist (z. B. führt eine Aufnahmeauflösung von 800 x 450 mit einer maximalen Bildrate von 25 FPS zu ca. 120 GB Filmmaterial pro Test). Protokoll zum Abrufen und Verarbeiten von Video Armieren Sie die Kamera zu Beginn jedes Beduftungsereignisses (2.3.10) und lassen Sie sie kontinuierlich bis zum Ende des Fokusereignisses (ca. 20 h) aufzeichnen. Schalten Sie nach Abschluss jeder Testphase die Kamera aus und rufen Sie die SD-Karte (2.4.4) ab. Übertragen Sie das Filmmaterial an den gewünschten Speicherort. Da SD-Karten Aufnahmegeräte häufig dazu zwingen, Filmmaterial in 5-minütigen Clips aufzunehmen, kombinieren Sie diese Clips mit einer Filmverarbeitungssoftware, um die Verarbeitung zu vereinfachen. Überprüfen Sie das Filmmaterial mit einem Mediendateiüberprüfungsprogramm, das eine variable Wiedergabegeschwindigkeit und anpassbare Vorwärtssprungintervalle ermöglicht.HINWEIS: Dies reduziert die Überprüfungszeit von etwa 20 h auf maximal 1 h, wenn während der Videoverarbeitung keine Feinauflösung erforderlich ist. Protokoll für den Betrieb von DufttierenHINWEIS: Die Schritte in diesem Abschnitt dauern aufgrund längerer Akklimatisierungszeiten für wilde Reptilien etwa 1,5 Tage. Siehe Bias-Vorwort in Abschnitt 1.3.1, um sicherzustellen, dass keine Verzerrung im Labyrinth gefunden werden kann. Tragen Sie beim Umgang mit Oberflächen oder Studientieren durchgehend Nitrilhandschuhe, um eine Geruchskontamination zu vermeiden. Legen Sie das duftende oder fokale Tier mindestens 24 Stunden vor dem Versuch zur Akklimatisierung in seine Box.HINWEIS: Um Stresseffekte zu minimieren, wird die Box in einem schattigen Bereich so nah wie möglich am Labyrinth belassen, ohne durch Reinigung oder andere Aktivitäten gestört zu werden. Stellen Sie sicher, dass alle getesteten Tiere (Duft, Fokal) auf diese Weise akklimatiert sind. Bereiten Sie neues, sauberes Duftpapier auf einer sauberen Oberfläche und von ausreichender Länge vor, um sich an der Verbindung des Y zu überlappen, und bedecken Sie die gesamte Unterseite (2 Armpapiere = 121,9 cm; 1 Basispapier = 152,4 cm). Befestigen Sie die Enden der Papiere in der Nähe der Boxen und der Y-Verbindung mit Abdeckband. Installieren Sie die Trennwände, um die Hälfte des Basisarms (links oder rechts) mit einer langen Trennwand zu blockieren, und blockieren Sie den Eingang zum gegenüberliegenden Arm mit einer kurzen Trennwand. Wenn Sie die Barrieren installieren, zerreißen Sie das Duftpapier nicht. Bei großen duftenden Tieren ist ein schwerer Gegenstand anzubringen, der leicht entfernt und hinter der Barriere als Spange gereinigt werden kann, um ein Versagen der Barriere zu verhindern (2.1.1.5).HINWEIS: Die Duftspur muss immer auf einer Seite der Basis beginnen und dann zum gegenüberliegenden Arm überqueren, damit die Wahl des Fokustieres klar ist. Schieben Sie die Acrylplatte abschnittsweise an ihren Platz und stellen Sie sicher, dass sich die Winkel vollständig treffen. Verwenden Sie klares Kunststoffband, um Lücken abzudecken. Befestigen Sie beide Armboxen am Labyrinth, indem Sie die Frontplatten mit Flügelnüssen und / oder Vorhängeschlössern verbinden, und stellen Sie sicher, dass die Türen offen verschlossen sind. Befestigen Sie zwei Stunden vor Sonnenuntergang die Basisbox (mit dem duftenden Tier) und stellen Sie sicher, dass alle Bewegungen langsam und gleichmäßig sind, um den Stress für das Tier zu minimieren. Arme die Kamera und öffne die Tür zur Basisbox, wobei Sie sicherstellen, dass die Tür mit beiden Laufbolzenschlössern an Ort und Stelle verriegelt wird. Bleiben Sie außerhalb der Sicht des Tieres und verlassen Sie den Bereich. Notieren Sie sich nach 3 h (1 h nach Sonnenuntergang) den Standort des Tieres im Labyrinth sowie die Umgebungsbedingungen. Wenn sich das Tier auf der Durchreise befindet, warten Sie, bis es in die Box gelangt. Wenn sich das Tier in einer Box befindet, schließen und sichern Sie die Boxtür, entfernen Sie die Box und entfernen Sie dann das Tier, wobei Sie darauf achten, eine defensive Geruchsablagerung in der Box zu verhindern. Wenn das Tier im Körper des Labyrinths bewegungslos ist, verwenden Sie visuelle Hinweise (z. B. lange Stange oder Handwinken), um seine Bewegung in eine Box zu stimulieren. Wenn das Tier übrig bleibt, entfernen Sie die Armbox(en), damit die Acrylplatte entfernt werden kann, und das Tier kann manuell gesammelt und in einen Beutel übertragen werden.HINWEIS: Beim Umgang mit großen Tieren ist immer eine angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) zu tragen (z. B. durchstichfeste Handschuhe, Augenschutz). Zerlegen Sie das Labyrinth teilweise, um die inneren Trennwände zu entfernen (vermeiden Sie es, das Duftpapier zu stören) und dann wieder zusammensetzen. Wenn eine Defäkation aufgetreten ist, sammeln und absorbieren Sie so viel wie möglich mit sauberen Mikrofasertüchern, aber waschen Sie den Bereich nicht. Fahren Sie mit Abschnitt 2.4 fort, um das Protokoll für die Ausführung von Brenntieren zu finden. Protokoll für die Durchführung von krepuskulären fokalen TierenHINWEIS: Die Schritte in diesem Abschnitt dauern etwa 2 Tage und müssen etwa zur gleichen Zeit wie der Beginn von Abschnitt 2.3 beginnen. Akklimatisieren Sie das geplante Fokustier mindestens 24 Stunden lang in der Box, bevor Sie im Labyrinth laufen. Führen Sie in den letzten Stunden der fokalen Tierakklimatisierung das duftende Tier aus, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen (2.3.9).HINWEIS: Timen Sie den Duftlegeschritt so nah wie möglich an den Zeitpunkt der Einführung des Brenntieres in das Labyrinth, um den Geruchsabbau zu reduzieren. Befestigen Sie die Basisbox (mit dem Brenntier) mit Flügelmuttern und/oder Vorhängeschlössern an der Basis des Y-Labyrinths. Verwenden Sie langsame, gleichmäßige Bewegungen beim Halten / Transportieren der Box, um den Stress für das Fokustier zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass beide Armkastentüren geöffnet sind. Beginnen Sie den Fokusversuch, indem Sie die Basiskastentür mit Laufbolzen öffnen und verriegeln. Bleiben Sie außerhalb der Sicht des Tieres und verlassen Sie den Bereich.HINWEIS: Bei wilden nächtlichen Reptilienversuchen werden Fokaltiere über Nacht gegeben, um das Labyrinth zu erkunden. Kehren Sie vier Stunden nach Sonnenaufgang zum Labyrinth zurück und folgen Sie Abschnitt 2.3.11.1, um das Brenntier zu entfernen. Sammeln Sie die SD-Karte der Kamera und laden Sie die Batterien bei Bedarf auf. Entsorgen Sie das gebrauchte Papier aus dem Labyrinth und fahren Sie mit der Reinigung fort (Abschnitt 1.5). Abbildung 1. Layout des USGS Y-Labyrinths. Auf der linken Seite zeigt ein Schema die Komponenten des Y-Labyrinths mit einem Maßstabsbalken für die Perspektive. Rechts zeigt ein Schnappschuss der Videokamera das Sichtfeld für Verhaltensaufzeichnungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Representative Results

Eine Vielzahl von Variablen kann aus Y-Labyrinth-Versuchen aufgezeichnet und/oder bewertet werden. Das Design der Studie sollte in erster Linie von den gewünschten Ergebnissen / Ergebnissen bestimmt werden. Wenn die Studie auf wiederholten Maßnahmen beruht (z. B. wiederholte Verwendung derselben brennenden Tiere), sind geeignete Test- und Analysestrukturen erforderlich. Da sich die USDA-Studien beispielsweise auf wiederholte Tests von fokalen Tegus stützten, wurde die Planung experimenteller Studien vollständig randomisiert. Auswahldaten: Die Mehrheit der Studien mit Y-Labyrinthen berichtet über einfache binäre Auswahldaten und analysiert die Ergebnisse mit parametrischen Statistiken wie einem Binomialtest. Die Haupteinschränkung hier ist die Stichprobengröße, die sich direkt auf die Leistungsfähigkeit jeder statistischen Analyse auswirkt. In Abbildung 2sind eine Reihe statistischer Schwellenwerte pro Stichprobengröße dargestellt, die zeigen, wie viele “Erfolge” auftreten müssten, damit ein bestimmter Binomialtest statistisch signifikante Ergebnisse liefert. Diese sind mathematisch abgeleitet und daher auf jeden Y-Labyrinth-Test verallgemeinerbar. Binomialstatistiken sind mit Online-Freeware einfach zu erstellen. Zur Berechnung von Wahrscheinlichkeiten werden One-Tail-Verteilungen verwendet, wenn eine a priori Begründung gegeben wird; Andernfalls sollte die Zwei-Schwanz-Verteilung verwendet werden. Die Wahl eines Arms wird oft durch die Entfernung bestimmt, die das Fokustier in einem bestimmten Arm bewegt. Der einfachste Weg, diesen Schwellenwert festzulegen, besteht darin, ein Wahrzeichen innerhalb des Labyrinths festzulegen. Für die meisten Y-Labyrinth-Studien ist das Wahrzeichen der Eingang der Armbox. Da Reptilien alle chemosensorischen Untersuchungen mit den chemisch erfassenden Organen im vorderen Bereich des Kopfes durchführen, steht der Kopf während eines Versuchs im Mittelpunkt. Da burmesische Pythons beispielsweise oft länger sind als das gesamte Labyrinth selbst, wird die Wahl am besten und effizientesten durch die Bewegung des Kopfes an einem Wahrzeichen vorbei bestimmt. Andere Optionen zur Bestimmung der Wahl sind die Zeit, die in einem Arm verbracht wird, und die vollständige Bewegung des Fokustieres in eine Box. Das Versagen wird dadurch bestimmt, dass ein Brenntier innerhalb eines bestimmten Zeitraums keine Wahl trifft. Aus Auswahldaten im Y-Labyrinth können genauere Auflösungsanalysen abgeleitet werden. Zum Beispiel können Forscher einen Choice Penalty Score16generieren. Hier müssen die Forscher verfolgen, inwieweit das Fokustier den Nichtzielarm des Labyrinths erforscht hat. Nicht-Ziel kann als der Arm definiert werden, den die Forscher a priori bestimmen, den das Fokustier nicht auf der Grundlage der getesteten alternativen Hypothese wählen wird. Das einfachste Beispiel für einen Nicht-Zielarm wäre der unfümierte Arm, wenn nur ein Arm einen Zielduft enthält. Komplexere Beispiele wären die Wahl zwischen zwei Düften aus derselben Quelle, die jedoch in unterschiedlichen Konzentrationen präsentiert werden7. Wenn das experimentelle Design mehrstufig ist und/oder die Daten von binär zu inkrementell werden, wie bei der Auswahlstrafe, sollte ein geeigneter statistischer Ansatz verwendet werden, z. B. die Analyse der Varianz durch wiederholte Messungen (ANOVA) oder andere Methoden, die mit kontinuierlichen oder proportionalen Datensätzen verwendet werden. Verhaltensweisen: Während der gesamten Dauer eines Experiments, in dem fokale Tiere beobachtet werden, kann eine Vielzahl von individuellen Verhaltensweisen quantifiziert werden. Diese Anzahl von Variablen kann entweder a priori in Abhängigkeit von dem, was bekannt ist, bestimmt werden16 oder post hoc nach vorläufigen Beobachtungen zu einer Teilmenge der Daten14,15. Die Studienziele und ihr Auflösungsgrad bestimmen, welche Verhaltensbewertungen innerhalb des Labyrinths vorgenommen werden sollten, wenn überhaupt (d.h. in vielen Studien werden nur Auswahldaten quantifiziert17). Verhaltensweisen können im gesamten Labyrinth, in Abschnitten oder während bestimmter Zeiträume bewertet werden. Zum Beispiel können Verhaltensweisen, die nur in der Basis oder an der Kreuzung der Arme gesehen werden, priorisiert werden8. Videoaufzeichnungen erleichtern die Verhaltensbewertung, obwohl die Auflösung des Videos und seine Länge – Faktoren, die Datenspeicherbeschränkungen mit sich führen – berücksichtigt werden sollten, bevor mit dem Experimentieren beginnt. Zeitliche Variablen: Wie bei Verhaltensvariablen können viele zeitliche Aspekte der Tierleistung während Y-Labyrinth-Versuchen quantifiziert werden. Zum Beispiel können Forscher Latenzzeiten zeitliche Zeiträume (z. B. Latenz, die aus der Box 8 hervorgeht) zeitliche Zeiträumeverwenden. Die meisten zeitlichen Variablen sind mit der Erkundung des Labyrinths verbunden, z. B. die gesamte Nachlaufzeit oder die zeit, die in jedem Arm verbracht wird. Diese Variablen werden in der Regel in einer Multifaktoranalyse wie Multi-Way-ANOVA analysiert. Voreingenommenheit des Beobachters: Bei allen Studien, die das Verhalten von Tieren betreffen, beeinflusst die Beobachterverzerrung die Datenerhebung signifikant18. Daher sollten Beobachter blind für die zu testende Behandlung sein. Der einfachste Weg, dies zu tun, besteht darin, die Videodateien numerisch zu codieren und sie dann zufällig zu sortieren (z. B. Zufallszahlengenerator), bevor sie Beobachtern zugewiesen werden. Die Kontrolle von Beobachterverzerrungen ist schwierig bis unmöglich, wenn die Live-Datenerfassung die einzige Option ist. In einem Feldumfeld würde dies zwei Kooperationspartner erfordern: einen Beobachter, der für die Behandlung blind ist, und einen Koordinator, der die Studie einrichtet. Umfangreiche Übersichten fassen die Auswirkungen von Experimentator-Bias auf die Datenerhebung und -interpretation in Verhaltens- und ökologischen Studienzusammen 18,19. Abbildung 2. Stichprobengrößen und P-Werte für Binomialtests aus Y-Labyrinth-Ergebnissen. Jede gegebene Stichprobengröße stellt eine festgelegte Anzahl von Versuchen dar, bei denen ein Duft in einem Arm des Y (Zielarm) getestet wird, während der andere eine Kontrolle (Nicht-Ziel) sein könnte. Die obere Zahl über jedem Balken ist der One-Tail-P-Wert für diese Anzahl von Zielarm-Auswahlen, unten ist Two-Tail. Zahlen innerhalb der oberen Leiste stellen die maximale Anzahl von Nichtzieloptionen dar, die traditionell noch statistisch signifikant sind (P < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Während Y-Labyrinthe sehr leistungsfähige Werkzeuge sind, um die chemische Ökologie bei Reptilien zu untersuchen, kann ihr begrenztes Design andere Wege der Untersuchung ausschließen. Es steht jedoch eine Vielzahl anderer Optionen zur Verfügung¹¹^,¹²^,²⁰^,²¹^,²². Zum Beispiel sind Zungenstreifen-Assays einfacher auszuführen und ermöglichen die gleichzeitige Beurteilung des Verhaltens einer Reihe chemischer Reize in Bezug auf Kontrollgerüche²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶. Freilichttests sind eine weitere Option, bei der ein brennendes Tier ein Gehege frei erkundet, bis es auf eine Quelle chemischer Hinweise stößt, und seine Verhaltensreaktionen anschließend^{mit 27}^,²⁸bewertet werden. Kombinationen dieser Ansätze können diskriminierende Fähigkeiten von Reptilien in unterschiedlichen Kontexten bewerten, z. B. eine Mischung aus künstlichen und natürlichen Gerüchen zusammen mit Refugien²⁹. Y-Labyrinthe können auch modifiziert werden, um Tiere luftgetragenen chemischen Hinweisen allein oder in Kombination mit substratgetragenen Hinweisen¹⁶^,³⁰auszusetzen, und Post-hoc-Inferenz kann verwendet werden, um die Datenerfassung neu zu gestalten, wenn archivierte Videodaten verfügbar sind³¹. Bioassays sollten so konzipiert sein, dass sie die Datenerfassung vereinfachen und widersprüchliche Reize minimieren, insbesondere wenn eine bestimmte Quelle von Hinweisen bewertet wird (z. B. chemische Hinweise²¹).

Forscher im Tierverhalten beobachten und quantifizieren häufig fokale Tierreaktionen in neuartigen, künstlichen Umgebungen (z. B. einem geschlossenen Labyrinth mit einer merkmallosen Landschaft), und es sollte darauf geachtet werden, ob ein bestimmtes Tier natürliches, exploratives Verhalten im Vergleich zu Vermeidung, Agitation oder ähnlichem verzweifeltem Verhalten zeigt. Distressed Tierisches Verhalten in Versuchsapparaten wird in erster Linie auf Neophobie zurückgeführt: Angst vor Neuheit³². Ein Beispiel ist das Fluchtverhalten, bei dem das brennweite Tier gegen die Gelenke oder die Kanten des Geräts drückt, um einen Austritt zu erreichen. Ein weiteres Beispiel ist Schüchternheit, bei der das Fokustier Eine Zurückhaltung beim Betreten des Labyrinths zeigt, deren Grad durch die Latenz des Labyrintheintritts quantifiziert werden kann. Das (Re-)Design von Geräten kann das Eingreifen des Brenntiers erleichtern, um diese verwirrenden Auswirkungen von Stress zu vermeiden. Der gebräuchlichste Ansatz ist die wiederholte Einführung des Brenntiers in den Apparat, um die Neuheit der Umwelt vor Beginn der Tests zu entfernen, und zeitgenössische statistische Modelle (z. B. verallgemeinerte lineare Mischmodelle) ermöglichen die Verwendung von Versuchstieren in mehreren Versuchen. Eine wichtige Nebenbemerkung, die für ökologische Überlegungen bei Verhaltenstests relevant ist, ist, dass reduzierte Neophobie mit dem Erfolg invasiver Arten verbunden ist³³. Abhängig von den a priori Kenntnissen der betreffenden Art kann Neophobie daher eine variable Bedeutung als experimentelle Designüberlegung haben.

Die Erfassung von Verhaltensdaten aus Videos bringt mehrere Einschränkungen mit sich, die zu großen Engpässen in experimentellen Zeitachsen werden. Beispielsweise kann die Länge einer bestimmten Studie die Datenextraktionszeit exponentiell erhöhen. Eine Problemumgehung besteht darin, das Verhalten nur so lange zu analysieren, bis ein Schwellenwert erreicht ist (z. B. Gesamtzeit aktiv). Der Schwellenwert kann auf dem längsten Video basieren, das für eine bestimmte Testversion verfügbar ist. Alternativ kann eine maschinenbasierte Beobachtung (z.B. Künstliche Intelligenz) entwickelt werden, obwohl dies zeit- und ressourcenintensiv ist und für die Qualitätskontrolle mit erheblichem Aufwand erforderlich ist. Ein weiteres Problem ist das Datenmanagement: Videos müssen von ausreichender Qualität sein, um eine Verhaltensbewertung und -bewertung zu ermöglichen, was zu Einschränkungen bei der Datenspeicherung führt. Während Cloud-Speicher jetzt zugänglich ist, sind Upload- / Download-Raten oft problematisch, insbesondere wenn die Datenerfassung an entfernten Feldstandorten stattfindet. Zusätzliche Herausforderungen manifestieren sich in den Einschränkungen von Aufzeichnungswerkzeugen, die die Integrität der Verhaltensbeobachtung beeinflussen. Eine klare Sicht auf das verhalten der Brenntiere ist immer notwendig, aber die Sichtbarkeit wird oft durch unkontrollierbare Faktoren (z. B. Feuchtigkeit, Insekten, Windbewegung) behindert. Wenn Aufnahmen aus einer einzigen Perspektive stammen (z. B. Aus der Vogelperspektive), sind Verhaltensweisen, die in der vertikalen Ebene auftreten (z. B.^{Kopfhebungen 14),}schwer zu beurteilen. Eine Lösung besteht darin, mehrere Kamerawinkel pro Test bereitzustellen. Schließlich beeinflusst die Tageszeit die Verhaltensaufzeichnung erheblich. Die nächtliche Verhaltensanalyse erfordert eine Kamera mit einem Nachtmodus und minimaler Lichtprojektion, um eine hinderliche Blendung auf der Y-Labyrinthoberfläche oder die Anziehung von Insekten zu vermeiden, die den Kamerafeed unterbrechen können. In Anbetracht des Vorstehenden kann die Vorkenntnis des Untersuchungsgebiets oder der Artenbiologie aufschluss darüber geben, welche Einschränkungen mit welcher Häufigkeit wahrscheinlich auftreten werden, und somit die wünschenswerten Stichprobengrößen beeinflussen.

Das Verhalten ist eng mit der Physiologie gekoppelt, und der Nutzen von Y-Labyrinthen für die Bewertung der Verhaltensendokrineologie bei einer Vielzahl von Arten wurde nachgewiesen. Dieses Papier betont jedoch einige Unterschiede bei der Durchführung dieser Experimente, abhängig von der Zielspezies, der Forschungsfrage und den verfügbaren Ressourcen. Daher sollte die Auswahl der Materialien und Abmessungen jedes Prüfaufbaus für eine mögliche spätere Forschungserweiterung sorgfältig überlegt werden. Abschnitt 2 beschreibt Änderungen an den in Abschnitt 1 beschriebenen Materialien, die aufgenommen wurden, um zukünftige, komplexere Verhaltensstudien mit Tegus zu ermöglichen. Die erhöhte vertikale Tiefe der Everglades-Labyrinthe wird es ermöglichen, neue Fragen zur chemischen Ökologie in wild gefangenen Tegus zu beantworten, ohne das Projektdesign und -setup übermäßig zu überziehen, was die Übersetzbarkeit dieses experimentellen Apparates weiter demonstriert.

Bei der Anwendung der oben beschriebenen Techniken in einer relativ abgelegenen Umgebung (siehe Abschnitt 2) müssen mehrere einschränkende Faktoren berücksichtigt werden, und die Projektplanung ist von größter Bedeutung. Abhängig von der statistischen Aussagekraft, die für das vorgeschriebene Behandlungsexperiment und den biologischen Zeitpunkt der Zielspezies erforderlich ist (z. B. Saisonalität), werden die erforderlichen Ressourcen und Arbeitskräfte beeinflusst. Wenn eine einmalige oder wiederholte Anwendung von Fokaltieren gewünscht wird, ist eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf die Verringerung potenzieller Stressoren erforderlich. Jeder dieser Faktoren verlängert entweder den Projektzeitplan oder erfordert mehr Arbeit, Platz und Material. Zum Beispiel stellt Abschnitt 2 die Verwendung von wild gefangenen männlichen Pythons als Brenntiere vor, die einer anderen Gruppe von wild gefangenen und hormonell manipulierten Männchen folgen, die alle etwa 24 Stunden ruhige Akklimatisierungszeit in Halteboxen benötigen, um Stresseffekte zu minimieren. Obwohl diese Akklimatisierungszeiträume die Testzeiten auf über zwei Tage verlängerten, beeinflusst Stress durch Gefangenschaft und Handhabung das Verhalten von Wildtieren und muss minimiert werden, um saubere Datensätze zu generieren³⁴^,³⁵.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Y-Labyrinthe leistungsstarke, anpassungsfähige Werkzeuge sind, mit denen die chemische Ökologie verschiedener Wildtiere unter sehr unterschiedlichen Bedingungen untersucht werden kann, vorausgesetzt, es gibt eine wachsame A-priori-Planung. Es muss sorgfältig übersorgt werden, geeignete Fragen zu wählen und den Versuchsaufbau für gegebene Taxa und Bedingungen richtig zu gestalten. Forscher und Manager können erheblich von der Verwendung von Y-Labyrinthen profitieren, um die chemosensorische Biologie von Tieren besser zu verstehen, da diese Tools flexible experimentelle Designs ermöglichen, die große Mengen an feinskaligen Verhaltensdaten liefern, insbesondere in Kombination mit Fernüberwachungstools.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Entwicklung des ersten Y-Labyrinths wurde durch Kooperationsvereinbarungen (15-7412-1155-CA, 16-7412-1269-CA und 17-7412-1318-CA) zwischen der James Madison University (JMU) und dem USDA Animal and Plant Health Inspection Service unterstützt. Die Entwicklung des Y-Labyrinths im Everglades National Park wurde durch eine Kooperationsvereinbarung (P18AC00760) zwischen der JMU und dem National Park Service finanziert. Wir danken T. Dean und B. Falk für ihre Unterstützung dieses Projekts im Everglades NP und die Unterstützung bei der Genehmigung und Finanzierung. Wir danken W. Kellow für die Unterstützung beim Bau des USGS Y-Labyrinths. C. Romagosa, L. Bonewell und R. Reed leisteten administrative und logistische Unterstützung. Wir danken den beiden anonymen Rezensenten, die hilfreiches Feedback gegeben haben. Die Finanzierung der Everglades-Arbeiten und die Sachleistungen wurden vom U.S. Geological Survey (USGS), dem Greater Everglades Priority Ecosystem Science Program, dem National Park Service (P18PG00352) und dem USGS Invasive Species Program bereitgestellt. Jede Verwendung von Handels-, Firmen- oder Produktnamen dient nur zu beschreibenden Zwecken und impliziert keine Billigung durch die US-Regierung. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in dieser Veröffentlichung wurden vom US-Landwirtschaftsministerium nicht formell verbreitet und sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie die Bestimmung oder Politik des USDA darstellen.

Materials

1" Steel zinc-plated corner brace	Everbilt, The Home Depot	13619	See Supplemental File 1, Step 2.1 "90 degree 2.5 cm steel corner brace"
121.92cm W x 304.8cm L x 1.27cm H white polypropylene Extended Range High-Heat UHMW Sheet	TIVAR	UHMNV SH	See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1. "white polpropylene")
182.88 cm L x 81.28 cm W x 0.64 cm Thick Clear Acrylic Sheet	Plexiglass	32032550912090	See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1.6. "Acrylic pieces")
2.54 cm W x 2.54 cm H x 243.84 cm L Mill-Finished Aluminum Solid Angle	Steelworks	11354	See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1.1. "aluminum angle bracket")
4.5 kg spool of 5 mm Round Polypropylene Welding Rods	HotAirTools	AS-PP5N10	See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1. "heat weld")
5 mm Plain Aluminum Rivets	Arrow	RLA3/16IP	See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1.1. "rivet")
Aluminum angle, 1.9 cm	Everbilt, The Home Depot	802527	See Supplemental File 1, Step 1.2 "aluminum angle (1.9 cm x 1.9 cm x 0.16 cm thick)"
Aluminum angle, 2.5 cm	Everbilt, The Home Depot	800057	See Supplemental File 1, Steps 1.2 and 2.2.2 "aluminum angle (2.5 cm x 2.5 cm x 0.16 cm thick)"
Aluminum angle, 3.2 cm	Everbilt, The Home Depot	800037	See Supplemental File 1, Step 1.2 "aluminum angle (3.2 cm x 3.2 cm x 0.16 cm thick)"
Aluminum flat bar 1" x 1/8" thick	Everbilt, The Home Depot	801927	See Supplemental File 1, Step 3.2.1 "aluminum strap"
Avigilon 2.0 MP camera	Avigilon, a Motorola Solutions Company	2.0C-H4SL-BO1-IR	See "1.5 Camera set-up and video acquisition" (step 1.5.1 "Avigilon 2.0 MP")
Avigilon NVR	Avigilon, a Motorola Solutions Company	HD-NVR3-VAL-6TB-NA	See "1.5 Camera set-up and video acquisition" (step 1.5.3 "NVR")
Clear acrylic sheet (5.6 mm thick)	United States Plastic Corp.	44363	See Supplemental File 1, Step 1.3 "clear acrylic sheet" and step 3.2.1 "clear acrylic door"
Fillet Weld Nozzle 3/16" x 15/32" / 4.5 x 12 mm	TRIAC	107.139	See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1. "heat weld")
Hanging File Folder Box	Sterilite	18689004	See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.2.1. "Boxes")
HardiePanel HZ10	James Hardie Building Products	9000525	See Supplemental File 1, Step 1.1 "fiber cement siding"
Heat Welding Gun	TRIAC	141.227	See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1. "heat weld")
Kraft Butcher Paper Roll, 24"	Bryco Goods	24 inch x 175 FT	See "1.2 Protocol for running scent-laying tegus" (step 1.2.1.2 "butcher paper")
Kraft Butcher Paper Roll, 46 cm wide	Bryco Goods	BGKW2100	See "2.3. Protocol for running scent-laying pythons" (step 2.3.4. "scenting paper")
Micro-90 Concentrated Cleaning Solution	International Products Corporation	M-9050-12	See "1.4 Breakdown and clean-up" (step 1.4.4 "laboratory-grade soap")
MKV ToolNix – Matroska tools for linux/Unix and Windows	Moritz Bunkus	v.48.0.0	See "2.2. Camera setup and video acquisition" (step 2.2.4.2. "movie processing software")
Network Camera	Axis Communications	M3104-LVE	See "2.2. Camera setup and video acquisition" (step 2.2.1. "Project camera")
Palight ProjectPVC 1/4"	Palram	159841	See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.2.3. "faceplate")
Palight ProjectPVC 1/8"	Palram	156249	See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.2.1. "door")
Privacy windscreen (green)	MacGregor	Size to fit	See Supplemental File 1, Step 4.2 "green heavy duty shade cloth"
Protective Glove, Full-Finger	ArmOR Hand	HS1010-RGXL	See "2.3. Protocol for running scent-laying pythons" (step 2.3.11.2. NOTE: "puncture-resistant glove")
REScue Disinfectant	Virox Animal Health	44176	See "1.5. Breakdown and clean-up." (step 1.5.4. NOTE "sanitation solution")
Reversable PVC trim, 1/2" x 24"	UFP Industries, Veranda products	H120XWS17	See Supplemental File 1, Step 2.1 "PVC board partition", and step 3.2.1 "thinner PVC trim boards"
S4S / Veranda HP TRIM	UFP Industries, Veranda products	H190OWS4	See Supplemental File 1, Steps 1.2, 2.2.2, and 2.2.3 "PVC board"
S4S / Veranda HP TRIM (1" x 8" Nominal)	UFP Industries, Veranda products	827000005	See Supplemental File 1, Steps 3.2.1 "PVC trim board"
ScotchBlue 24 in. Pre-taped Painter’s Plastic	3M	PTD2093EL-24-S	See "1.2 Protocol for running scent-laying tegus" (step 1.2.1.3 "plastic sheeting")
Sterilite 114 L tote box	Sterilite Company	1919, Steel	See Supplemental File 1, Step 3.2 "arm box"
Sterilite 189 L tote box	Sterilite Company	1849, Titanium	See Supplemental File 1, Step 3.2 "Base box"
Super Max Canopy	ShelterLogic	25773	See Supplemental File 1, Step 4.3 "white canopy"
VLC Media Player	VideoLAN	v.3.0.11	See "2.2. Camera setup and video acquisition" (step 2.2.4.3. "media file reviewing program")
White Pavilion Tent	King Canopy	BJ2PC	See Supplimental File 2 "3. Enclosure materials and consideratons" (step 3. "pavilion tent")

Referenzen

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Parker, M. R., Currylow, A. F., Tillman, E. A., Robinson, C. J., Josimovich, J. M., Bukovich, I. M. G., Nazarian, L. A., Nafus, M. G., Kluever, B. M., Adams, A. A. Y. Using Enclosed Y-Mazes to Assess Chemosensory Behavior in Reptiles. J. Vis. Exp. (170), e61858, doi:10.3791/61858 (2021).