주변 신경 또는 척수 타박상 부상으로 설치류의 기능적 회복을 평가하기 위한 자동 걸음걸이 분석

모든 실험에 대한 실험 프로토콜은 비엔나 시 정부의 동물 프로토콜 검토 위원회에 의해 사전에 승인되었습니다. 모든 절차는 헬싱키 동물권 선언과 국립 보건원의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 완전히 수행되었습니다. 1. 동물 주택 음식과 물에 대한 광고 리비툼 액세스와 12 h 빛 / 어두운 주기에서 250-300 g무게 집 수컷 쥐 (루이스 또는 스프라그 Dawley) . 실온(20~22°C에서 유지) 및 습도(45%-65%) 적절한 동물 주택에 대한. 이 작품을 위해, 남성 루이스 (PNIs)와 스프라그 Dawley (SCI) 쥐가 사용되었다. 일주일에 두 번 새로 청소된 케이지를 제공합니다. 2개 또는 3개의 그룹으로 쥐를 수용하고 그들의 사회적 행동과 상호 작용을 면밀히 모니터링합니다. 쥐는 수술 절차 또는 기능 적 테스트 전에 적어도 1 주일의 적응 기간을 허용합니다.참고: 쥐는 수술 전에 걸음걸이 분석 장치에 대한 일일 훈련의 최소 5 일을 필요로하므로 시설에서 쥐가 도착하고 실험 수술(28)에대한 예정된 데이터 사이에 적어도 2 주를 계산하십시오. 2. 신경 상해의 유도 참고: 수술 용 가운, 장갑 및 마스크와 같은 개인 보호 장비를 착용하십시오. 멸균 수술 가운을 사용할 수없는 경우, 깨끗하고 세탁 된 실험실 코트도 충분합니다. 오염되지 않는 한, 가운이나 코트는 동물 들 사이가 아니라 수술 세션 사이에 변경될 필요가 없습니다. 멸균 수술 용 장갑의 사용을 권장합니다. 이러한 장갑을 사용할 수없는 경우, 검사 장갑도 사용할 수 있지만 수술 소독제를 사용하여 수술 전에 세척해야합니다. 장갑은 동물 들 사이 변경 해야 합니다. 수술 당일, 마취를 방해할 수 있기 때문에 동물에게 스트레스를 최소화하려고 노력합니다. 수술 당일, 수술 전 및 수술 간 진통을 제공하기 위해 수술 전 25 G 카누라 1h를 사용하여 100-200 μL 0.9 % NaCl 피하로 서스펜션에 0.05 mg Buprenorphine / kg 체중을 주입하십시오. 달리 표시하지 않으면 쥐의 측면이 주입을 선호하는 부위입니다. 세보플루란 기화기와 CO2를흡수하기 위해 활성 분필 용기에 연결된 마취 유도 챔버에 쥐를 배치하여 쥐를 마취시키는 것으로 마취한다. 1.5 L/min(개시 단계)의 산소 흐름을 사용하여 약 5분 동안 마취 상자를 4%-5%의 세보플루란-산소 혼합물로 범람시킴으로써 쥐를 마취한다. 펄스 산소 측정 클립을 발 중 하나에 연결하여 설치류의 혈액 산소 포화도를 모니터링합니다. 전신 마취 상태를 유지 하 여 2.5%-4.5% 세보플루란-산소 혼합물.참고: 실험 수술의 경우 전신 마취는 의무적입니다. 꼬리 또는 발의 핀치 자극에 대한 응답의 부족을 확인하여 전신 마취를 확인합니다. 쥐가 전신 마취에 들어갔을 때, 알코올 및 피부 소독제로 교대로 스 와이프하여 작동 될 각 반실을 면도하고 소독하십시오. 마지막 스 와이프는 피부 소독제로 수행해야합니다. 필요한 위치에 조절 가능한 가열 패드에 놓습니다 (대퇴 신경 모델의 경우 좌골 및 SCI 모델에 대한 경향이 있음). 쥐의 직장에 유연한 온도계 프로브를 삽입하여 동물의 온도를 모니터링하고 수술 중 약 37 °C에서 유지하십시오. 마취 중, 눈 연고를 사용하여 건조로부터 쥐의 눈을 보호 3. 신경 상해의 외과 유도 외과 적 수술을 수행 할 때, 다음과 같이 Halsted29의 일곱 가지 원칙을 엄격하게 준수하십시오. 그들과 함께 작업 할 때 항상 부드럽게 조직을 처리합니다. 조직을 찢거나 분쇄하지 마십시오.참고: 자체 제작30 개 또는 시판되는 리트랙터 시스템은 근육과 선박을 수술장에서 벗어나는 데 도움이됩니다. 조심스럽게 혈관또는 합자를 소작하기 위해 전기 헤모스타를 사용하여 hemostasis를 신중하게 유지하여 신중한 헤모스티스를 보장합니다. 항상 신중하게 해부하고 섬세하게 처리하여 조직에 혈액 공급을 유지합니다. 마스크, 가운, 멸균 장갑을 착용하여 엄격한 기전을 유지합니다. 너무 단단하거나 너무 느슨하지 않은 봉합사를 적용하여 조직에 긴장을 피하십시오. 겹치지 않고 각각의 가장자리를 하나로 모아 조직을 꼼꼼하게 제거합니다.참고: 이것은 에피네뇨 또는 천동맥 신경증의 경우에 특히 중요합니다. 작동 현미경을 사용하여 6x-16배 배율하에서 모든 미세 수술 절차를 수행합니다. 이상적으로, 현미경은 조수에 의하여 작동의 관찰을 허용하는 안구의 2 쌍을 제공합니다. 다른 조직 층을 신중하게 봉합하여 죽은 공간의 생성을 피하십시오. 오른쪽 뒷다리의 진부신경 신경성 유도 #3 메스 손잡이에 연결된 #10 메스 블레이드로 뒷사지의 등쪽에 5cm 길이의 절개를 수행하고 과부하 근육과 연조직을 해부하여 중위 수준에서 올바른 시차 신경을 노출시다. 상처 내부에 리트랙터를 배치하여 해부된 근육과 피부를 시상에서 제거합니다. 곡선된 미세 수술 가위를 사용하여 주변 조직을 제거하여 신경을 부드럽게 노출시합니다. 직선 미세 수술 가위로 삼각에 좌골 신경 1-2 mm 근분의 8mm 긴 신경 세그먼트를 제거합니다. 신경 세그먼트를 180°회전시키고, 간질 신경의 근위와 탈구 그루터기 사이에 놓고 각 부위에 두 개의 중단된 10-0 봉합사 및 미세 수술 바늘 홀더를 수행합니다. 오른쪽 뒷다리에 대퇴 신경 신경 성 신경 증의 유도 올바른 대퇴 신경 혈관 번들을 노출시키기 위해 #3 메스 손잡이에 연결된 #10 메스 블레이드로 세로 3-4cm 사타구니 절개를 수행하십시오. 대퇴 신경의 양분이 드러날 때까지 무딘 해부에 외과 가위를 사용합니다. 상처 내부에 리트랙터를 배치하여 해부된 근육과 피부를 시상에서 제거합니다. 노출된 모터와 감각 가지를 분기로 분리하고 각 분기의 6mm 길이의 신경 세그먼트를 각각 직선 미세 수술 가위를 사용하여 배설합니다. 신경 세그먼트를 180°로 회전시키고, 대퇴 신경 가지의 근위와 탈모 그루터기 사이에 배치하고 각 부위에 두 개의 중단된 11-0 봉합사및 미세 수술 바늘 홀더를 사용하여 각 부위에 과피뇨 신경을 수행합니다.참고: 원래 모터 브랜치에 모터 이식편을 접목하고 감각 이식편을 원래 감각 지점에 이식하여 동모성 자가 신경 이식편을 수행합니다. 대안적으로, 원래 감각 지점에 모터 이식편을 접목하여 이종성 자가 신경 이식편을 수행하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 흉부 척수 타박상 부상의 유도 #3 메스 손잡이에 연결된 #10 메스 블레이드와 근육 회수를 용이하게하기 위해 가시 공정에 평행한 두 개의 근육 절개를 통해 흉부 척추를 가로 질러 피부 절개를 수행하십시오. 상처 내부에 리트랙터를 배치하여 해부된 근육과 피부를 시상에서 제거합니다. 11 번째 흉부 척추 (Th)를 식별하고 강구르를 사용하여 회전 조직뿐만 아니라 회전 공정을 제거하여 척추 아치의 라미나를 노출시하십시오. 마이크로 드릴과 적절한 버를 사용하여 라미네절제술을 수행하여 작은 구멍을 라미나에 드릴링하여 충격기의 끝보다 약간 큽을 수 있습니다. 척수 손상을 방지하기 위해, 만 개봉하고 rongeur를 사용하여 구멍을 확대하는 동안 라미나 밖으로 얇게. periosteum이 여전히 손상되지 않은 경우, 듀라 마터를 손상시키지 않고 날카로운 뾰족한 프로브를 사용하여 조심스럽게 제거하십시오. 라미나 불안정을 해소하지 않고 충분히 큰 구멍이 만들어지도록 한 후, 충격기의 안정화 집게로 Th11에 장밋되고 caudally 클램핑하여 동물의 척추를 제자리에 고정시하십시오. 앞면과 측면에 있는 핸드 휠을 사용하여 강철 막대를 라미네절제술 구멍 위에 3-5mm 를 배치합니다. 마지막으로, 모든 동물을 150킬로다인의 정의된 힘으로 충격으로 발동하여 경증에서 중간 정도의 척수 타박상 손상4를유도한다. 폴리글락틴 4-0 또는 5-0 중단 봉합사 및 수술 바늘 홀더를 사용하여 해부학 적 층에서 상처 폐쇄를 수행합니다. 멸균 0.9% NaCl에 담근 거즈 패드로 부드럽게 닦아 상처를 철저히 닦아줍니다. 수술 후, 동물을 집 케이지로 돌려 보내 빛과 음울 노출로부터 보호하십시오. 수술 후 날(DPO) 7일까지 동물의 행동을 면밀히 모니터링하고 충분한 식량과 수분 섭취를 보장합니다. 필요한 경우 피하 주사(예: 10 ml NaCl 0.9%)에 의해 추가 유체를 제공합니다. 수술 후 진통제를 최소 2일 동안 제공, 예를 들어, 오피오이드 (0.05 mg/kg 체중 Buprenorphine 피하 (s.c)) 및 /또는 해열제 (4 mg/kg 체중 Carprofen s.c.). 필요한 경우, SCI 모델의 경우 수술 후 항생제 요법(os(p.o.)당 7.5 mg/kg 의 체중 Enrofloxacin을 제공합니다. 척수 손상의 경우, 자발적인 배뇨가 돌아올 때까지 쥐의 방광을 수동으로 비웁웁튀습니다. 4. 걸음걸이 분석 전에 외과 적 개입에서 회복 참고: 좌골 신경 손상을 가진 쥐는 신경 상해 다음 고통스러운 신경병증의 개시 때문에 그들의 뒷발에 gnaw 하는 경향을 보여줍니다. 이러한 형태의 자동 절단은 발가락 또는 각 뒷드 발의 일부를 자가 절단할 수 있습니다. 이 쥐 균주는 자가 절단(31)에대한 작은 경향을 나타내기 때문에, 진부한 신경 부상 모델을 사용할 때 다른 쥐 균주보다 루이스 쥐를 선호합니다. 상골 신경 상해를 가진 쥐는 또한 데이터 수집과의 간섭 때문에 연구 결과에서 그들의 제외귀착될 수 있는 수술한 사지의 계약서를 개발하는 경향을 보여줍니다. 이러한 부작용 대퇴 손상 쥐에서 훨씬 덜 일반적인 발생. 수술 후 매일 수술후 수술한 동물을 검사하여 각각 팔다리와 발의 상태에 주의하십시오.참고: SCI를 가진 쥐에서, Th11의 절정에, 음경 또는 직장 탈출소변과 배변하는 동물의 자연적인 능력의 손상으로 인해 발생할 수 있습니다. 이 사건은 일반적으로 연구 결과의 인간 적인 끝점으로 정의되고 연구 결과에서 영향 받은 동물의 즉각적인 제외를 암시합니다. 쥐가 통증 관련 증상을 표시 하는 것을 중단 할 때까지 수술 후 진통을 계속. 지속적인 통증의 경우, 신경 병 증 통증을 치료 하는 gabapentin (30-120 mg/kg 체중) p.o. 관리. 5. 자동 걸음걸이 분석 수행 전 준비 참고: 걸음걸이 분석 시스템의 방법론은 녹색 LED 조명으로 조명되는 유리 판을 건너는 동안 아래에서 동물을 기록하는 것을 기반으로 합니다. 동물의 발이 바닥에 닿으면 발 프린트 의 영역이 조명되고 고속 비디오 카메라로 기록됩니다. 그런 다음 이더넷 케이블을 통해 보행 분석 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터로 전송됩니다. 개별 발자국은 실험자가 수동으로 분류할 수 있지만 최신 소프트웨어 버전에는 자동 설치 공간 분류도 포함되어 있습니다. 어두운 곳에서 방해가 되는 소음이 없는 상태에서 모든 테스트 절차를 수행합니다. 쥐는 초음속 주파수를 인식 할 수 있기 때문에, 또한 어떤 소스가 같은 소리를 방출하지 않는지 확인.참고: 매주 또는 격주로 걸음걸이 분석을 수행하지만, 특히 루이스 쥐가 특정 운동에 너무 자주 노출될 때 시간이 지남에 따라 절차에 참여하는 데 관심을 잃는 경향이 있기 때문에 쥐를 너무 자주 테스트하지 마십시오. 그러나 수술 전 5일 동안 매일 쥐를 훈련하여 시험 환경과 절차에 적응해야 합니다. 훈련 세션 과 테스트 당일에는 모든 광원을 끄면 행동 테스트 룸을 준비하여 자동화 된 걸음걸이 분석 장치의 카메라를 방해 할 수 있습니다. 빛이 카메라를 방해하지 않도록 카메라에서 데이터 수집에 필요한 컴퓨터 화면을 배치합니다. 데이터 수집 절차를 심각하게 방해하므로 장치가 안정적인 위치와 진동을 방지하는 방식으로 설치되어 있는지 확인하십시오. 행동 시험장에 쥐를 가지고 테스트하기 전에 적어도 30 분 동안 자신의 홈 케이지에 적응.참고: 동물을 다룰 때마다 외과 가운이나 실험실 코트, 장갑, 마스크 와 같은 개인 보호 장비를 착용하십시오. 6. 자동 걸음걸이 분석 수행 교육 세션참고: 훈련 중에 동물은 학습 곡선을 거치므로 훈련 일정을 점진적으로 조정하는 것이 좋습니다. 각 트레이닝 세션을 성공적으로 마친 후 동물에게 보상하기 위해 음식 보상(예: 아침 시리얼 1-2개)을 사용하십시오. 훈련 첫날, 동물을 트렁크 밑에 잡고 부드럽게 운반하여 보도 입구로 운반합니다. 동물을 입구 에 놓고 시험 절차를 수행하는 사람의 간섭없이 복도의 개구부를 탐험할 수 있습니다.참고 : 비명을 지르거나 휘파람을 불거나 동물을 찌르지 마십시오. 이러한 모든 행동은 동물을 심각하게 강조하고 데이터 수집 절차를 더욱 복잡하게 만듭니다. 동물이 자발적으로 산책로를 건너 집 새장에 도달 할 때까지 기다립니다. 때로는, 특히 훈련되지 않은 동물에서, 이것은 몇 분까지 걸릴 수 있습니다. 첫 번째 훈련 날에, 동물은 균일 한 보행 속도로 중단 실행을 할 필요도 없습니다. 대신 테스트 장치 및 절차자체에 적응해야 합니다. 훈련 둘째 날, 익숙한 동물들은 주저없이 산책로에 들어가고, 또한 주저없이 자신의 집 케이지로 돌아갑니다. 일부 동물은 아마 이미 중단없이 보도를 건너 배웠습니다,하지만이 여전히 두 번째 날의 끝에 필요하지 않습니다. 훈련 셋째 날, 동물들이 주저하지 않고 보도를 건너거나 스니핑하거나 탐색적인 움직임을 하지 않도록 하십시오. 균일한 속도로 걸을 수 있습니다. 훈련 의 네 번째와 다섯 번째 날에, 테스트 절차를 통합하기 위해 이전 운동을 반복합니다.참고: 동물이 5일 간의 훈련 기간이 끝날 때까지 보도를 제대로 통과하는 데 필요한 기술을 습득하지 못하는 경우, 2일의 추가 훈련(예: 주말)을 추가합니다. 또한, 개별 세션 사이에 적어도 2 h의 휴식으로 분리된 하루에 최대 3회의 교육 세션을 수행하는 것이 좋습니다. 케이스의 95%에서, 동물은 이 연장된 훈련 기간이 끝날 때까지 필요한 훈련 경험을 취득하게 될 것입니다. 드문 경우 동물은 여전히 훈련 7 일 후이 기술을 습득하지 않은, 적어도 1 주 동안 계획된 실험 수술 세션을 연기하고 전술 한 훈련 정권을 반복하는 것이 좋습니다. 7. 데이터 수집 참고: 걸음걸이 분석 시스템은 동물이 걷는 동안 각 발 인쇄를 시각화하고 발 인쇄 영역, 발 인쇄 강도, 발 스윙 시간 및 발 스윙속도(표 1)와같은 다양한 걸음걸이 매개 변수를 자동으로 분석합니다. 걸음걸이 분석 시스템이 동물의 발 프린트에 의해 생성된 강도에 따라 모든 데이터를 기록하므로 쥐의 무게와 크기에 따라 카메라 설정을 조정해야 합니다. 또한 데이터 수집에 영향을 주지 않도록 데이터 기록 전에 통로가 건조하고 깨끗해졌는지 확인합니다. 데이터를 수집하기 전에 상업용 유리 클리너와 스퀴지를 사용하여 보도를 청소하십시오. 유리 판을 여러 번 뿌린 다음 스퀴지로 닦아 표면에서 입자를 제거합니다. 또한 아래를 청소하십시오. 동물이 그렇지 않으면 그것에 단계 수 있기 때문에 보도의 끝에서 어떤 액체를 제거 해야, 기록 된 데이터에 영향을 미칠 것 이다. 필요할 때마다, 예를 들어, 보도의 오염과 다른 케이지에서 쥐의 데이터를 기록하기 전에 청소 절차를 반복합니다. 이것은 동물이 동특화의 향기에 의해 산만해지는 것을 방지하기 위하여 생각됩니다. 첫 번째 데이터 수집 에 앞서 동물의 무게에 맞는 카메라 설정을 조정합니다. 가장 가볍고 무거운 동물을 보도로 배치하여 이를 확인하고 두 경우 모두 데이터 품질을 양호할 수 있는 카메라 설정을 선택합니다. 카메라 게인, 적색 천장 표시등, 녹색 보도 라이트 및 녹색 강도 임계값(GIT)을 조정하여 최적의 발 인쇄 감지를 보장합니다.참고: 데이터 수집이 시작된 후 선택한 설정을 변경하지 마십시오. 예외로 GIT는 데이터 분류 중에 변경할 수 있지만 모든 평가판에 대해 균일하게 수행해야 합니다. 제공된 교정 시트를 사용하여 보도를 정의하고 보정합니다. 설치 탭에 나열된 등록된 카메라를 선택합니다. 획득 탭에서 찾을 수 있는 열기 획득 버튼을 클릭합니다. 다음 데이터 수집 절차 전반에 걸쳐 참조로 사용되는 빈 정리된 보도의 스냅숏을 가져옵니다. 스냅샷 대기에서 취득 준비로 변경된 상태를 기록합니다. 시작 획득 버튼을 클릭하고 획득 준비에서 시작 실행 대기로 상태가 변경됨을 확인합니다. 통로에 쥐를 놓고 컴퓨터 화면에 동물의 움직임을 따릅니다. 실행 대기대기에서 녹화 실행까지의 상태 변경 사항에 유의하십시오.참고: 소프트웨어는 녹색 기호가 있는 사전 설정된 실행 특성에 따라 준수한다고 판단되는 실행을 자동으로 분류하고 비준수 실행은 빨간색 기호로 표시됩니다. 세 번의 호환 실행이 기록되면 소프트웨어가 자동으로 데이터 수집을 중지하지만 데이터 수집 시작 버튼을 다시 클릭하여 데이터 수집을 계속할 수 있습니다. 8. 데이터 분류 참고: AGA 결과 매개 변수 목록은 표 1을 참조하십시오. 동물이 망설이지 않고 꾸준히 보도를 건너야 하는 적어도 세 번의 준수 실행이 필요합니다27. 또한 실행 속도는 문헌30에정의된 것과 동일한 범주 내에서 일치해야 합니다. 분류할 각 시험의 실험 탐색기 탭에서 분류 버튼을 클릭합니다. 획득한 실행을 일반 속도로 재생하여 데이터가 이전에 나열된 요구 사항을 준수하는지 여부를 노출합니다. 왼쪽 위 쪽 모서리에서 자동 분류 버튼을 클릭하여 소프트웨어에 의한 발 인쇄를 자동으로 분류합니다.참고: 소프트웨어는 올바른 발 분류 비율이 높지만 인쇄에 발을 할당하거나 잘못된 발을 할당하지 못하는 경우도 있습니다. 따라서 자동 분류 된 발 인쇄를 항상 다시 확인하십시오. 일반 단계 시퀀스 패턴(NSSP)을 올바르게 계산하려면 분류 알고리즘이 보이지 않는 발 인쇄로 혼동되지 않도록 하여 결함이 있는 NSSP(그림1A)로이어집니다. 따라서, 콘트라탈 발이 NSSP 계산, 예를 들어, 왼쪽 앞발(LF)과 오른쪽 뒷발(RH)(도1B)에대해서도 볼 수 있는 동안 검출가능한 발 인쇄만 포함한다. 그림 1: 모범적인 AGA 데이터로 올바른 데이터 분류를 수동적으로 다시 검사해야 합니다. 전방 발의 검출된 배치가 다른 전방발(A)의검출된 배치에 의해 성공한 경우 AGA 소프트웨어는 뒷발이 검출되지 않았기 때문에 이를 조정되지 않은 보행 패턴과 혼동할 수 있다. 따라서, 항상 이중 확인 및 콘트라탈 발도 볼 때 감지되는 초기 발 인쇄를 선택하는 것이 좋습니다(B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 9. 통계 계산 참고: 시간이 지남에 따라 체중 증가 관련 변경에 대한 실행 데이터를 조정하려면 실험적이지 않은 발(예: 컨트롤) 발로 실험용 발의 비율을 계산하는 것이 좋습니다. 또한 발 사용의 개별 차이를 고려하여 이 발 대 발 비교의 수술 전 값에 대한 비율을 계산합니다. 통계 실행 보기 버튼을 클릭하여 실행 통계에 대한 포괄적인 개요를 확인합니다. 파일 및 내보내기를 선택하여 실행 통계 또는 평가판 통계를 스프레드시트 소프트웨어로 내보냅니다.