在 伊 蚊中喂养和量化动物衍生的血液和人工膳食

血液喂养程序不使用活体动物或人类宿主进行，并符合洛克菲勒大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）和机构审查委员会（IRB）制定的准则。 1. 膳食准备 法戈刺激剂，腺苷5+三磷酸酯的制备 准备25米水性NaHCO3 溶液（分子量，兆瓦=84.006克/摩尔）。对于 100 mL 的 25 mM NaHCO3，将 210 毫克 NaHCO3 添加到体积烧瓶中，并填充双蒸馏水（ddH2O），总体积为 100 mL。使用磁搅拌棒，彻底混合溶液，直到所有 NaHCO3 溶解。 在水性 25 mM NaHCO3 中重组 ATP 脱钠盐水合物 （MW = 551.14 g/mol），最终浓度为 200 mM ATP。对于总体积为 10 mL 的 200 mM ATP 在 25 mM NaHCO3 缓冲区，将 1.1 克 ATP 脱钠盐水合物添加到体积瓶中，并填充 25 mM NaHCO3 缓冲器，总体积为 10 mL。使用磁搅拌棒，彻底混合溶液，直到所有 ATP 溶解。注：要尽量减少ATP的水解，必须通过纳赫科3等盐溶液进行缓冲。 阿里引用ATP解决方案，并在-20°C存储。注：ATP的这种库存解决方案通常每六个月新鲜一次，用于下面描述的所有膳食。为了防止退化，ATP 别名不应经历多个冷冻解冻周期，也不应与其他膳食组件一起加热。 荧光示踪剂溶液、荧光素的制备 准备2%（w/v）的液态荧光素库存溶液。对于总库存溶液量为 10 mL，在室温下用铝箔包裹的 15 mL 锥形管中混合 0.2 克荧光素脱钠盐和 10 mL 的 ddH2O。这种荧光素的库存溶液可用于以下所有膳食的稀释。注：由于荧光素对光敏感，请用铝箔包装容器，避免暴露在光线下。 准备动物源性血液餐 计算喂养所有蚊子所需的膳食数量;每个格利图伯有一顿2mL的饭菜，喂养大约25只蚊子。准备一顿额外的膳食，以校准荧光读数的标准曲线。除非另有说明，否则本节中的所有步骤都描述了准备一顿饭所需的试剂量，最终体积为 2 mL。 对于动物源性血液餐，将 1.98-2 mL 除颤羊血转移到 15 mL 锥形管中（参见步骤 3.3，以获得所需的血液量）。注：商业去除脊椎动物血液来源，包括绵羊、豚鼠和人类，可使用13。使用前，确保所购血液未过期，并通过倒置瓶子将其混合好，尤其是在血液成分明显分离的情况下。 为了获得最佳喂养，在水浴中将羊血加热到 45 °C 后，将 ATP 添加到 1-2 mM 的最终浓度中。对于 1 mM ATP 的最终浓度，在 200 mM ATP 库存解决方案中添加 10 μL，加入 1.99 mL 的预热血和混合液。对于 2 mM ATP 的最终浓度，将 200 mM ATP 库存中的 20 μL 添加到 1.98 mL 的预温血液和混合物中。如果不添加 ATP，加热 2 mL 的除颤羊血。 如果随后要对膳食大小进行基于荧光的量化，则将荧光素溶液添加到最终浓度为 0.002% （2 μL 的 2% 荧光素库存在 2 mL 总膳食量中）。将血液量减少与添加的荧光素相同的量。保留含有 0.002% 荧光素的最终膳食配方的 1 mL 以生成参考标准曲线。将保留的体积与提供给蚊子的膳食相同;在整个实验过程中暴露在相同的光线和温度条件下，然后与送餐一起冷冻。 制备人造血餐 计算喂养所有蚊子所需的膳食数量;每个格利图伯有一顿2mL的饭菜，喂养大约25只蚊子。准备一顿额外的膳食，以校准荧光读数的标准曲线。除非另有说明，否则本节中的所有步骤都描述了准备一顿 2 mL 餐所需的试剂量。 为了准备人造血液（改编自科根（1990年）22），如 表1，首先使库存溶液400 mM NaHCO3。 总容量为 10 mL 的 400 mM NaHCO3 （MW = 84.006 g/mol），将 336 毫克 NaHCO3 添加到体积烧瓶中，并填充双蒸馏水（ddH2O），总体积为 10 mL。使用磁搅拌棒，彻底混合溶液，直到所有 NaHCO3 溶解。 对于人造血液的蛋白质成分，在400 mM NaHCO3中制备50毫克/毫升γ球蛋白、在ddH2O中35毫克/mL的血红蛋白和在ddH2O中300毫克/毫升的白蛋白的库存溶液，蛋白质库存溶液可在4°C储存长达2个月。人造血液中人类蛋白质总量的最终浓度为125毫克/mL。这包括15毫克/mL γ球蛋白、8毫克/mL血红蛋白和102毫克/mL白蛋白的最终浓度。 每2毫升餐，结合600μL的γ球蛋白，460μL的血红蛋白，680μL的白蛋白，和250μL的ddH2O从 表1中列出的股票解决方案。等待添加 10μL 的 200 mM ATP 库存解决方案，直到饭后加热到 45 °C，然后立即呈现餐食。 如果随后要对膳食大小进行基于荧光的量化，则将荧光素溶液添加到最终浓度为 0.002% （2 μL 的 2% 荧光素库存在 2 mL 总膳食量中）。在步骤4.4中减少 ddH 2 O 的体积，其量与添加的荧光素相同。保留含有0.002%荧光素的最终膳食配方至少1 mL以生成参考标准曲线。将保留的体积与提供给蚊子的膳食相同;在整个实验过程中暴露在相同的光线和温度条件下，然后与送餐一起冷冻。 准备无蛋白盐水餐（改编自杜瓦尔等人（2019）7）注：无蛋白质盐水餐可以以多种方式准备7，27，32。这里介绍的盐水餐是上述人工血液配方的无蛋白质版本。 计算喂养所有蚊子所需的膳食数量;每个 Glytube 都提供 2 mL 餐食，并喂养大约 25 只蚊子，准备一顿额外的膳食，以校准荧光测量的标准曲线。除非另有说明，否则本节中的所有步骤都描述了准备一顿 2 mL 餐所需的试剂量。 要准备盐水餐，制作 400 mM NaHCO3的库存溶液。对于总体积为 10 mL 的 400 mM NaHCO3 （MW = 84.006 g/mol），将 336 毫克的 NaHCO3 添加到体积烧瓶中，并填充 ddH2O，总体积为 10 mL。使用磁搅拌棒，彻底混合溶液，直到所有 NaHCO3 溶解。 对于每2毫升餐，结合在一个15毫升锥形管600μL的400 mM NaHCO3 与1.39毫升的ddH2O.等待添加10μL的200 mM ATP库存解决方案，直到饭后已加热到45°C在水浴。 如果随后要对膳食大小进行基于荧光的量化，则将荧光素溶液添加到最终浓度为 0.002% （2 μL 的 2% 荧光素库存在总膳食量的 2 mL 中）。在步骤5.3中减少 ddH 2 O 的体积，其量与添加的荧光素相同。保留含有0.002%荧光素的最终膳食配方至少1 mL以生成参考标准曲线。将保留的体积与提供给蚊子的膳食相同;在整个实验过程中暴露在相同的光线和温度条件下，然后与送餐一起冷冻。 2. 送餐给蚊子 设置供喂养的蚊子容器注：只要符合以下标准，蚊子就可以在各种容器中喂养。确保容器足够大，蚊子可以飞来飞去，但不要太大，蚊子很难找到网状表面并开始进食。用于覆盖容器的网格在材料和孔大小上可能有所不同。孔必须足够大，雌性蚊子的风格穿透，但不是那么大，蚊子可以逃脱。牢牢地固定网格，使其绷紧，Glytube 在整个喂食期间可以稳定地放在其表面上。 例如容器 （图 1）是一个经过改装的 946 mL （32 盎司） 高密度聚乙烯 （HDPE） 塑料桶。要复制此设置，请使用剃须刀刀片在桶盖中切割直径约 10 厘米的中央孔。要组装容器供蚊子占据，在桶顶上固定一块约 400 厘米2 平方的白色 0.8 毫米聚酯蚊帐，将穿孔盖牢牢地推倒在水桶上，以紧握。 收集关闭后至少3天的雌性蚊子，以确保它们足够成熟，可以喂血。最佳喂养率在7天33后观察到。 将雌性蚊子放入容器中，并盖上网状。如果容器中密布蚊子，则增加使用的胶合管数量。最佳喂养是通过+25蚊子/胶管实现的。这减少了获得喂食膜的竞争。 留出一组未受控制的蚊子，这些蚊子不会得到一顿饭。在体重测量协议中，分别对未受约束的组进行称重，并使用此重量来估计以膳食为食的实验组的体重增加。在基于荧光的量化协议中，将未受约束的蚊子群添加到井中，用于标准曲线计算和负控制。为了匹配实验组的基线蚊子组织自荧光，确保标准曲线和负控制井包含未受蚊子。 建造和建立格利图布 （改编自科斯塔 – 达西尔瓦等人 （2013）20） 如 图 1所示，要生成热源，请将 50 mL 锥形管填充 40 mL 的 100% 甘油。用 5 厘米× 5 厘米的护膜密封打开的圆锥管，再加一块 5 厘米× 5 厘米的护膜，以最大限度地减少泄漏的机会。可选地，可以使用橡皮筋将准胶片放在原位。倒置管，以确保没有孔或缝隙。 要创建送餐装置，只需使用锋利的剃须刀刀片或车床，在圆锥管螺钉盖上切割一个直径为 2.5 厘米的中心孔。均匀地伸展一块 5 厘米× 5 厘米的准胶片，使其大小大致翻倍。准胶片应该足够薄，蚊子很容易穿透它，但不应该有泄漏。密封螺钉盖的外表面，以完全覆盖孔，并设置盖子一边。注意：为了增加对Glytube的吸引力，在拉伸护膜之前，用人类的气味来香水，轻轻揉在一块没有化妆品的人体皮肤上，注意不制造任何孔洞。如果实验的目的不是调查蚊子接近膳食所需的感官线索，建议这样做。 在42-45°C的水浴中加热甘油和膳食的密封管（除ATP外的所有组件），至少15分钟。不要预热ATP：在开始实验前立即添加它。 将 ATP 添加到加热的膳食中，并彻底转到漩涡中。移液器 2 mL 的加热餐进入螺丝帽的内室，轻轻地将倒置、加热、甘油填充的 50 mL 锥形管放入螺丝帽中。部分拧盖与膳食甘油填充管-只是足以防止泄漏的膳食或甘油。注意：使用的膳食量在1 mL和2.5 mL之间。当餐食用于提供稀缺或昂贵的化合物时，较低的体积可能特别有用。在此步骤中快速工作非常重要，以便膳食不会冷却到环境温度，并降低最大进食的可能性。冷却速度将取决于执行这些步骤的房间的环境温度，但通常应在 5 分钟内在 25 °C 完成。 将组装好的 Glytube 放在蚊子容器的顶部，让蚊子至少食用 15 分钟，以达到最大喂养率。 为了获得最佳的喂养，请将蚊子容器放置在装有 CO2 垫的室内，并在送餐前在 25-28 °C 和 70-80% 的湿度下进行至少 15 分钟的适应。这里使用的检测室是一个简单和低成本的修改，以前公布的设置16。它使用半透明聚丙烯存储盒大小 36 厘米 L × 31 厘米 W × 32 厘米 H 与可拆卸盖。室壁上直径为 1.5 厘米的孔允许通过硅胶管输送 CO2。 CO2 扩散垫贴在盖子的内侧中心，用于输送净化空气和 CO2， 以在试验期间调节室内气氛。注意：确保宿主提示（热和二氧化碳，可选宿主气味16）存在，以便蚊子被吸引到膜喂食器。如果蚊子没有挤在 Glytube 下面，请检查 CO2 是否正确传递，膳食和 Glytube 是否足够温暖。如果外部 CO2 源不可用，CO2 可以通过呼出的人类呼吸气泡传递。 喂养后，Glytube 帽可以作为生物危害废物丢弃，或浸泡在低百分比漂白液中并彻底冲洗在水中后再使用。 3. 消费膳食的量化 称量蚊子用于进一步实验注：称量蚊子以量化膳食大小允许它们用于进一步的活体实验，但这种方法需要从一组5只蚊子中测量体重。由于使用大多数实验室平衡很难精确测量单个蚊子的重量，因此无法通过测量重量轻松量化单个膳食大小的变异性。仅建议女性明显在用餐时进行称重。 冷麻醉蚊子通过移动他们的容器到4°C的冷室或把它放在冰上。 称量组5女性从未提供一组（即蚊子从来没有提供一顿饭），并计算他们的平均体重作为估计的”喂养前”重量。未受蚊子的平均重量取决于基因型、性别和饲养条件。未受雌性 Ae. aegypti 蚊子饲养， 与 广告利比图姆 接触蔗糖通常每个重约 2 毫克。 从实验队列（即提供膳食的蚊子），根据眼睛7可观察到的腹部分量，将雌性分成”喂”和”不喂”的桩。将每个”喂”和”不喂”的堆分别分成5组蚊子进行称量。每组5人中的蚊子应来自同一实验组，用于进行组重量测量。计算实验组每个”喂养”和”未喂养”堆中每个女性的平均体重。 荧光测量，用于终点分析7,27,34注意：要从不再需要进一步活体实验的单个蚊子那里获得精确的膳食大小测量，请在进食后立即将含有0.002%荧光素的1mL食物储存在-20°C。实验可以在这里暂停。此方法概述在 图2.要生成参考标准曲线，则准备对提供给实验组蚊子的含有 0.002% 荧光素的同一餐进行连续稀释。总共将有 8 个标准曲线解决方案。在每种解决方案中，含有 0.002% 荧光素的最终膳食量为 5、2.5、1.25、0.625、0.3125、 0.15625， 0.078125， 或 0 μL， 每个将在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 总体积 100 μL （例如， 5 μL 的膳食含有 0.002% 荧光素在 95 μL 的 1x PBS）. 要使标准曲线的第一个解决方案，添加 50 μL 的膳食含有 0.002% 的荧光素到 950 μL 的 1x PBS 和漩涡彻底（最终体积：5 μL 的膳食含有 0.002% 的荧光素在 95μL 的 1x PBS）。要制作其余标准曲线解决方案，请从上一个管子中取出 500μL 并将其添加到包含 500μL 1 倍 PBS 的新管中，为每一步执行 2 倍稀释。在准备下一次 2 倍稀释之前， 漩涡很好。 要准备用于生成参考标准曲线的油井，在 96 井 PCR 板的第一列中，每个标准曲线解决方案的移液器 100 μL 进入每个 8 口油井。在板的第一列相同的 8 口井中添加 1 个未受控制的蚊子。在板的第二列中重复以进行复制测量。注：如果实验组提供不同的膳食类型，则必须为每种膳食类型准备一个单独的参考标准曲线。 在未对照组和实验组的每个剩余井中添加 100 μL 的 1x PBS。如果组织要在随后的步骤中使用珠磨同质化剂或旋涡中断，则在每口井中添加一个 3 mm 的玻利西酸固体玻璃珠。 作为负控制，在板的后 2 列中，在每口井中添加 1 只未清除的蚊子。该组测量的荧光设置基线截止，以解释组织自荧光，并将用于确定实验组中的蚊子是否在膳食中喂养。 在提供膳食的实验组的剩余油井中，每口井增加1只蚊子。 小心密封板，通过手动研磨破坏组织。腹部应彻底同质化以释放膳食。破坏组织的方法包括使用珠磨机同质化剂，具有3毫米的波罗西酸固体玻璃珠（30赫兹30秒），涡流搅拌机与3毫米波罗西酸盐固体玻璃珠，或无珠子的刺磨机。 以 2000 rpm 的速度将盘子离心 1-2 分钟，以收集碎液。 准备一个黑色的 96 井板，每口井有 180μL 的 1x PBS。 将 20 μL 的利酸盐转移到每口井，并混合 180μL 的 1x PBS 并混合。如果可用，请在此步骤中使用多通道移液器，以提高速度和更好的一致性。 使用 485/520 激发/排放通道上的板式读取器测量每口井的荧光强度。通过根据相应的荧光强度测量绘制已知的膳食量，生成参考标准曲线。 使用生成的参考标准曲线，推断每个实验组蚊子摄入的膳食量。从每个实验组个体的荧光强度读数中减去未受蚊子负对照组的平均荧光强度读数，以校正基线组织自荧光。