JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Umwelt

Simulazione di camini idrotermali della Terra primordiale in un ambiente a gradiente termico

Published: February 27, 2021
doi:
10.3791/61789
, ,
1NASA Jet Propulsion Laboratory,California Institute of Technology, 2The University of Tulsa

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è quello di formare camini idrotermali simulati tramite esperimenti di iniezione chimica da giardino e introdurre un gradiente termico attraverso la membrana precipitata inorganica, utilizzando un condensatore stampabile in 3D che può essere riprodotto per scopi educativi.

Abstract

Le bocche idrotermali di acque profonde sono precipitati auto-organizzati generati da squilibri geochimici e sono stati proposti come possibile scenario per l’emergere della vita. La crescita di camini idrotermali in un ambiente a gradiente termico all’interno di un sistema di sfiato della Terra primordiale è stata simulata con successo utilizzando diversi simulanti idrotermali, come il solfuro di sodio, che sono stati iniettati in un simulante oceanico della Terra primordiale contenente ferroso disciolto. Inoltre, è stato sviluppato un apparecchio per raffreddare sufficientemente il simulante oceanico vicino a 0 °C in un recipiente a condensatore immerso in un bagno di acqua fredda mentre si inietta una soluzione di solfuro a temperatura calda o ambiente, creando efficacemente una struttura del camino artificiale in un ambiente con gradiente di temperatura per un periodo di poche ore. Tali esperimenti con diverse sostanze chimiche e gradienti di temperatura variabili hanno portato a una varietà di morfologie nella struttura del camino. L’uso di simulanti oceanici e fluidi idrotermali a temperatura ambiente ha portato a camini verticali, mentre la combinazione di un fluido idrotermale caldo e di un simulante oceanico freddo ha inibito la formazione di robuste strutture del camino. Il condensatore personalizzato stampato in 3D creato per questo studio agisce come un vaso di reazione incamiciato che può essere facilmente modificato e utilizzato da diversi ricercatori. Consentirà l’attento controllo della velocità di iniezione e della composizione chimica dei simulanti di sfiato e oceanici, che dovrebbero aiutare a simulare con precisione le reazioni prebiotiche in sistemi di camini con gradienti termici simili a quelli dei sistemi naturali.

Introduction

I camini idrotermali sono precipitati chimici da giardino auto-organizzati generati da squilibri geochimici all’interno di ambienti di sfiato di acque profonde mentre il fluido riscaldato e idrotermalmente alterato filtra in un oceano più freddo. In uno scenario primordiale della Terra, è stato proposto che i camini si formassero in antiche prese d’aria alcaline e che il transetto dei gradienti ambientali di pH / redox / chimici avrebbe potuto guidare le reazioni verso l’emergere del metabolismo1,2,3,4,5,6. Le prese d’aria idrotermali sono state anche postulate per esistere su altri pianeti tra cui i mondi oceanici, Europa ed Encelado7,8,9,10. Vari esperimenti sono stati condotti per simulare aspetti della chimica del camino idrotermale prebiotico proposto, tra cui la precipitazione di minerali catalitici di solfuro di ferro che potrebbero ridurre CO211,12,sintesi organica guidata da gradiente13,14, 15e incorporazione di sostanze organiche nelle strutture del camino16. Nel creare configurazioni sperimentali per imitare le prese d’aria idrotermali, sia sulla Terra che su altri mondi, è essenziale considerare i gradienti geochimici e la natura aperta e lontana dall’equilibrio del sistema per produrre simulazioni realistiche.

Oltre a pH, redox e gradienti chimici, le prese d’aria idrotermali impongono anche un gradiente termico attraverso la membrana / parete del camino a causa dell’alimentazione del fluido di sfiato riscaldato in un ambiente freddo del fondo marino. Le temperature oceaniche fredde del fondo marino possono variare in funzione della profondità, della penetrazione solare e della salinità; le profondità oceaniche medie del fondo marino nei siti di sfiato (principalmente nelle dorsali medio-oceaniche) sono nell’intervallo di 0-4 ° C17. A seconda del tipo di sfiato, il gradiente termico tra oceano e fluido di sfiato può variare notevolmente: dai gradienti più lievi delle prese d’aria alcaline, come Lost City18,19 o il campo idrotermale di Strytan dove il fluido di sfiato è 40-90 ° C20,21, ai fumatori neri del fondo marino profondo dove il fluido di sfiato può raggiungere diverse centinaia di gradi Celsius22, 23,24,25. Dal punto di vista dell’origine della vita, la simulazione dei gradienti termici nei sistemi idrotermali è significativa in quanto potrebbero influenzare la mineralogia e la reattività chimica dei precipitati del camino3,13 e / o potrebbero influenzare l’abitabilità poiché i camini idrotermali ospitano microbi che assumono elettroni direttamente dalle superfici minerali26. In un gradiente attraverso la parete del camino, una gamma di condizioni di temperatura sarebbe presente su una breve distanza e la parete del camino rappresenterebbe una combinazione di minerali e reazioni caratteristiche di tutti questi regimi termici.

Camini idrotermali coltivati in laboratorio in gradienti termici sono stati simulati per esplorare gli effetti dell’oceano freddo e del fluido idrotermale caldo su questo potenziale ambiente prebiotico. In generale, poiché la coltivazione di camini idrotermali simulati tramite un metodo di iniezione con un interno riscaldato e un esterno freddo presenta sfide pratiche, gli esperimenti di camino più accessibili sono quelli eseguiti a pressione ambiente (quindi non richiedono reattori costosi e complicati). I precedenti tentativi di camini coltivati in laboratorio in un gradiente termico non sono stati in grado di produrre sia un fluido idrotermale caldo / caldo che un oceano freddo. Nel tentativo di mantenere l’intero camino ad alta temperatura per lunghi periodi per formare minerali reattivi che possono guidare le reazioni organiche, alcuni studi hanno riscaldato l’intero esperimento (oceano e fluido idrotermale) a ~ 70 ° C usando una giacca riscaldante o un bagno caldo13,14. Un altro tipo di esperimento di formazione del precipitato del camino, in un apparato a “celle a combustibile”, formava il simulante della parete del camino su una maschera a membrana piatta; questi esperimenti sono stati anche riscaldati alla rinfusa immergendo l’apparato gradiente della cella a combustibile in un bagno di acqua calda27,28. Studi precedenti hanno formato camini idrotermali simulati da fluidi idrotermali caldi (riscaldati a ~ 70 ° C utilizzando vari metodi) iniettati in un oceano a temperatura ambiente3,12; tuttavia, un oceano freddo non è stato tentato.

Questo lavoro avanza metodi per simulazioni di laboratorio di crescita prebiotica del camino4 per creare un gradiente termico realistico da un oceano freddo (0-5 ° C) a un fluido idrotermale riscaldato in cui sintetizzare materiali del camino e testare le proprietà di interesse. Ad oggi, non ci sono stati esperimenti prebiotici sul camino condotti con successo con un gradiente di temperatura realistico per le prese d’aria alcaline: con la soluzione di sfiato interno mantenuta a ~ 70 ° C e la soluzione oceanica esterna raffreddata a ~ 5 ° C. Inoltre, nei pochi esperimenti di camino riscaldato che sono stati condotti, la configurazione sperimentale è complessa e può essere costosa. Gli esperimenti sui giardini chimici hanno un grande potenziale per fornire informazioni sui processi che potrebbero aver avuto luogo nelle prese d’aria idrotermali sulla Terra primordiale. Quindi, la capacità di impostare rapidamente più varianti di un esperimento di camino è vantaggiosa, così come la possibilità di avere un apparato semplice che è economico, non fragile, facilmente modificabile e ideale per gli studenti con cui lavorare. Qui viene presentato un nuovo apparecchio (Figura 1) progettato per facilitare la crescita di un camino idrotermale simulato mantenendo e monitorando un gradiente termico realistico tra l’oceano freddo e il simulante fluido idrotermale riscaldato. Questo apparato sperimentale è simile nel design a un reattore a camicia, ma è un condensatore stampato tridimensionale (3D) che può essere facilmente prodotto da qualsiasi gruppo di ricerca interessato a condurre esperimenti simili (vedi File stampabile supplementare ). Utilizzando questo condensatore stampato in 3D, sono stati condotti esperimenti sul camino a gradiente termico per testare l’utilità di questo apparecchio per mantenere robusti gradienti di temperatura e per testare gli effetti dei gradienti di temperatura sulla struttura e la morfologia del camino.

Protocol

1. Considerazioni sulla sicurezza Utilizzare dispositivi di protezione di laboratorio per la protezione individuale tra cui guanti in nitrile, occhiali per il viso, camice da laboratorio e scarpe adeguate (nessuna pelle esposta). Quando si usano siringhe e aghi, fare attenzione a non perforare guanti o pelle. Controllare l’intero apparecchio nella cappa aspirante per eventuali perdite. Controllare la stabilità dei flaconcini di vetro e del condensatore sul supporto prima di aggiungere qualsiasi sostanza chimica alla miscela. Operare tutti gli esperimenti di gradiente termico nei fumi per contenere le fuoriuscite d’acqua. Utilizzare tutto il solfuro di sodio (Na2S•9H2O) nei fumi in quanto pericoloso per la salute. Mantenere il solfuro di sodio nella cappa aspirante e posizionare una bilancia all’interno della cappa aspirante per pesare la quantità di solfuro. Tenere sempre le soluzioni contenenti solfuro all’interno della cappa aspirante poiché rilasciano gas H2S tossico e mantenere liquidi solforati, taglienti e contenitori per rifiuti solidi nella cappa aspirante. Non mescolare rifiuti di soluzione di solfuro con altre sostanze chimiche note. Quando si utilizza il reagente Fe(II)Cl2•4H2O, spurgare costantemente con N2/Ar mentre si ossida all’esposizione all’aria. Mantenere le soluzioni anossiche nella cappa aspirante posizionando il gas N2/Ar nello spazio di testa all’interno della cappa aspirante. Fissare con parafilm per evitare ulteriori ossidazioni. 2. Configurazione per esperimenti di iniezione Blocca l’iniezione del condensatore stampato in 3D su un supporto in una cappa aspirante, in modo che il piccolo foro della porta sia rivolto verso il fondo della cappa aspirante. Assicurarsi che il condensatore sia livellato all’interno del morsetto. Creare “vasi per iniezione” in vetro tagliando 1 cm dal fondo di un flacone di siero a crimpare da 100 mL di vetro trasparente (tipo di chiusura con guarnizione a crimpare da 20 mm) utilizzando una taglierina per vetro e assicurarsi che il recipiente sia aperto all’aria dal basso verso l’alto. Pulire i flaconcini in un bagno acido HCl da 1 M durante la notte, quindi risciacquare con acqua a doppio distillato (ddH2O) prima di condurre un nuovo esperimento. Riutilizzare il vetro a meno che non sia rotto o rotto, quindi smaltire. Preparare i flaconcini per iniezione (Figura 1). Raccogliere i seguenti materiali: un setto da 20 mm, una guarnizione a crimpare in alluminio da 20 mm, una punta per pipetta in plastica da 0,5-10 μL, un ago per siringa da 16 G e uno strumento crimper. Forare con attenzione un foro al centro del setto di gomma, quindi rimuovere e scartare l’ago in un contenitore per rifiuti taglienti. Inserire la punta della pipetta nel foro dell’ago, nel lato del setto di gomma che sarà rivolto all’interno della parte superiore a crimpare del flaconcino. Spingere la punta della pipetta attraverso il setto in modo che fuoriecci leggermente dall’altra parte.NOTA: non spingere fino in fondo, in quanto ciò non darà spazio sufficiente per posizionare il sigillo a crimpare con lo strumento crimper. Posizionare il crimper sul sigillo a crimpare. Spremere il crimper e sigillare il setto con la punta della pipetta sul recipiente di iniezione per renderlo impermeabile. Dopo aver sigillato correttamente, spingere la punta della pipetta attraverso il barattolo di vetro, in modo che sporga di circa 1,0 “dal vetro. Posizionare un tubo trasparente, flessibile e resistente agli agenti chimici di 1/16 “di diametro interno sulla punta della pipetta per ottenere una tenuta stagna sulla punta della pipetta.NOTA: il tubo deve essere abbastanza lungo da raggiungere la siringa da 16 G sulla parte superiore della pompa della siringa poiché la siringa pomperà il fluido idrotermale attraverso questo tubo trasparente nel simulante oceanico. Posizionare le fiale di iniezione nel condensatore stampato in 3D nella cappa aspirante, serpeggiando il tubo attraverso il foro della porta del condensatore sul fondo. Assicurarsi che il flaconcino sporga dal piccolo foro della porta nel condensatore.NOTA: se si devono utilizzare più condensatori, è possibile impostare più flaconcini contemporaneamente e alimentarlo contemporaneamente con siringhe separate. Verificare la disponibilità di eventuali perdite finali inserendo una siringa da 10 mL riempita con ddH2O e con un ago da 16 G nell’altra estremità del tubo aperto. Inserire con attenzione l’ago da 16 G nel tubo in modo da non forare il tubo. Iniettare lentamente il ddH2O in modo che si sposti verso l’alto del tubo e nel fondo del recipiente di reazione per garantire che la siringa / tubo, il tubo / punta e le guarnizioni a crimpare siano tutti a tenuta stagna. Fissare saldamente il parafilm sulla parte superiore tagliata del flaconcino e posizionare un piccolo pezzo di nastro adesivo sulla parte superiore del parafilm. Perforare un piccolo foro attraverso il nastro in modo che l’O2 possa fuoriuscitare mentre N2/ Ar viene pompato. Impostare linee di gas N2/Ar che alimenteranno ciascuna in una delle fiale di iniezione dalla parte superiore di taglio per rendere il flaconcino di vetro anossico prima che il simulante oceanico venga versato. Dividere l’alimentazione del gas da una sorgente N2/Ar in più tubi, in modo che ci sia un alimentatore N2/Ar per ogni fiala di iniezione (se si conducono più esperimenti). Posizionare la siringa (collegata a N2/Ar) perforando il nastro, passando sopra la soluzione oceanica nel flaconcino. Fare attenzione a non penetrare la soluzione oceanica con l’ago per evitare l’interruzione della crescita del camino. 3. Preparazione di soluzioni per la crescita chimica del giardino Preparare il simulante oceanico Preparare 100 ml di soluzione per ogni esperimento.NOTA: in questo esempio, utilizzare la Tabella 1 per concentrazioni specifiche come cationi precipitanti. Creare soluzioni anossiche facendo bollire prima 100 mL di ddH2O con gas N2/Ar per ~15 min per 100 mL in un pallone Erlenmeyer. Pesare e aggiungere uno qualsiasi degli ingredienti della chimica dell’oceano, mescolando delicatamente per sciogliersi (non vigorosamente in modo da non introdurre ossigeno). Dopo aver sciolto i reagenti, riprendere immediatamente il leggero gorgogliamento del simulante oceanico con gas N2/ Ar durante la preparazione delle iniezioni idrotermali. Preparazione del simulante del fluido idrotermale (preparazione del solfuro di sodio) Scegliere una delle concentrazioni di iniezione mostrate nella Tabella 1e preparare 10 ml di ciascuna concentrazione. Riempire le siringhe da 10 ml con le soluzioni. Sostituire i tappi dell’ago e mettere da parte.NOTA: Tenere sempre le soluzioni contenenti solfuro e le siringhe nella cappa aspirante. Pesare la quantità necessaria di solfuro di sodio (Na2S•9H2O) solo nella cappa aspirante (50 mL di soluzione con ddH2O). Riempire un tubo centrifugo da 50 mL con ddH2O. Posizionare il Na2S•9H2O nel tubo della centrifuga da 50 mL e sigillarlo saldamente nella cappa aspirante. Agitare accuratamente il tubo nella cappa aspirante fino a quando tutte le particelle di solfuro sono completamente dissolte. Mantenere la soluzione anossica nella cappa aspirante utilizzando parafilm in cui è stato inserito un ago da 10 G che inietta N2/Ar. 4. Configurazione del termistore Posizionare il termistore in una posizione stabile su una panca laterale il più vicino possibile alla cappa aspirante. Inserire il lato USB di un cavo adattatore RS232 nella porta USB del computer. Accendere l’alimentazione per il termistore. Per istruzioni sulla configurazione delle resistenze per cavi, vedere Procedura di termistore nell’appendice supplementare 2. Accendere il software del termistore sul computer. Scorri verso il basso fino a Porta di comunicazione. Selezionare le prime porte di comunicazione e fare clic sul pulsante Connetti a sinistra per ciascuna porta, fino a quando il termistore non si connette al software.NOTA: il software mostrerà le barre di configurazione di lettura in verde. L’icona di campionamento continuerà a lampeggiare, mostrando che sta campionando la temperatura corrente a intervalli frequenti. Se nessuno di questi segnali viene osservato, scegliere altre porte di comunicazione. Se nessuna delle porte di comunicazione funziona, viene visualizzato un messaggio popup che indica Errore di comunicazione o Impossibile comunicare. Se viene visualizzato un errore di comunicazione, chiudere il programma e riavviare. Ricontrolla i cavi a nastro e assicurati che siano collegati correttamente ai pin sulle piedine dei cavi RS232. Una volta connesso, assicurati che Output legga il 100% nelle barre rosse. Una volta che il termistore lampeggia frequentemente misurazioni a intervalli, modificare il tempo di intervallo a 60 s. Nella casella Opzioni controller, verso il basso, deselezionare 1 s e passare a 60 s. Fare clic sul pulsante OK. Ci sarà un pulsante ovale accanto al logo dell’azienda etichettato Auto-scale. Fai clic su quel pulsante per attivare la scalabilità automatica. Nota la linea gialla che mostrerà la lettura della temperatura. All’interno dell’area di stampa, fate clic con il pulsante destro del mouse per regolare la trama a vostro piacimento, ad esempio ridimensionando gli assi x e y. Fare clic con il pulsante destro del mouse nell’area della trama e fare clic su Esporta in Excel prima che inizi una nuova lettura ogni 5000 s o 83,33 minuti (a seconda dell’intervallo di registrazione scelto). Salva i dati di temperatura e tempo nel foglio di calcolo creato automaticamente dal programma. Posizionare la sonda termistore metallica nella nave oceanica di vetro all’interno del condensatore. Assicurarsi che la sonda sia impostata sul lato del vetro poiché la sonda termistore appesa al centro della fiala di vetro interromperà la crescita del camino. Coprire di nuovo con parafilm. 5. Impostazione del bagno di ghiaccio Prendi una padella di plastica più grande e un secchio di medie dimensioni. Riempi il secchio con acqua fino a metà strada. Posizionare il secchio all’interno della padella e posizionare il ghiaccio all’interno dell’acqua fino a quando non è quasi pieno. Posizionare i due tubi di plastica su entrambe le estremità della pompa dell’acqua (Appendice supplementare 3, Figura 1). Si noti che l’apertura verticale della pompa è dove l’acqua verrà versata per iniziare l’adescamento e l’apertura orizzontale è dove l’acqua viene espulsa. Collegare la pompa a una presa di corrente, ma lasciare aperti i connettori elettrici in quanto alimenteranno la pompa quando sono collegati. Collegare il tubo di plastica orizzontale (Appendice supplementare 3, Figura 2) alla porta del condensatore più alta, rivolta verso destra, assicurandosi che il tubo sia abbastanza lungo da raggiungere il secchiello del ghiaccio. Posizionare un altro tubo di plastica tagliato sulla porta del condensatore sinistra (inferiore), assicurandosi che anche questo tubo sia abbastanza lungo da raggiungere il bagno di acqua ghiacciata. Posizionare questo tubo sopra il secchio di acqua ghiacciata in cui l’acqua verrà espulsa dal condensatore. Versare acqua fredda attraverso il tubo collegato all’apertura verticale della pompa. Quando la pompa è piena d’acqua, raggiungendo fino alla porta del condensatore, immergere il tubo nel bagno di acqua ghiacciata e collegare immediatamente i connettori elettrici.NOTA: questa opzione potrebbe richiedere due persone. Avviare la pompa per iniziare a far scorrere l’acqua attraverso il condensatore, riempire il secchio con ghiaccio e posizionare un termometro nel secchio per controllare la temperatura.NOTA: la temperatura dell’acqua dovrebbe raggiungere ~ 0 °C. Vedere la prova di controllo nell’appendice supplementare 1 Figura 2. Continua ad aggiungere altro ghiaccio per mantenere l’acqua a una temperatura fredda, rimuovendo parte dell’acqua più calda. 6. Preparazione per l’iniezione Portare le siringhe ddH2O (paragrafo 2.3) verso il basso accanto alle siringhe per iniezione di liquido idrotermale. Far scorrere con attenzione il tubo di iniezione in plastica dall’ago della siringa ddH2O e trasferirlo immediatamente direttamente su uno degli aghi primari della siringa per iniezione.NOTA: Non forare la parete del tubo. Collegare la piastra riscaldante per riscaldare il simulante idrotermale a 70-80 °C.  (Attenzione: temperature più elevate possono deformare o danneggiare la siringa di plastica.) Avvolgere il tampone attorno alla siringa di solfuro e avvitare saldamente due morsetti metallici attorno al tampone (Appendice supplementare 3, Figura 3). Una volta fissati i morsetti in posizione, posizionarli sulla pompa della siringa e fissare saldamente la pompa (dipende dalla pompa a siringa scelta). Impostare la temperatura sulla scatola di controllo a ~70 °C premendo il tasto freccia su (Appendice supplementare 3, Figura 5). Premere set/start. Una volta che la siringa o le siringhe riscaldate sono bloccate in posizione sulla pompa della siringa, impostare la pompa della siringa in modo che inietti a 1-2 ml/h. Verificare che le soluzioni oceaniche siano completamente dissolte. Se torbido, mescolare fino a quando non si scioglie per lo più. Titolare il simulante oceanico a pH 5,5 per simulare l’acidità dell’oceano adeano30,31. Utilizzare 10 M HCl e aggiungere goccioline lentamente (sotto l’alimentazione N2/ Ar) fino a quando il pHmetro legge un 5,5 stabile. Se supera 5,5, utilizzare NaOH per riportare il pH a livelli più elementari utilizzando lo stesso metodo a goccioline lente. Versare una o due soluzioni oceaniche nei vasi prefabbricati del camino. Versare una soluzione oceanica nel flaconcino di vetro all’interno del condensatore e l’altra nel recipiente a temperatura ambiente senza condensatore (se si conducono due esperimenti) (Figura 6).NOTA: non spostare la sonda di temperatura. Sigillare la parte superiore dei flaconcini di vetro con parafilm. Sostituire l’alimentazione N2/Ar nella parte superiore dello spazio di testa del simulante oceanico, facendo attenzione a non introdurre l’ago nel simulante oceanico. Programmare la pompa della siringa in modo che venga iniettata a 1-2 mL/h (calibrare per le dimensioni della siringa utilizzata, a seconda del tipo di pompa della siringa), ma non premere Start. Per evitare che la perdita termica si verifichi attraverso la lunghezza del tubo, iniettare rapidamente il fluido caldo per avere un contatto immediato con il serbatoio dell’oceano. Quindi, lasciare che l’iniezione ese/ 1-2 ml / h nell’oceano freddo. (Vedere la prova termica per la siringa nell’appendice 1 supplementare). Usa i becchi di scarto per catturare eventuali gocce. Avviare l’iniezione e iniziare a registrare la temperatura dell’oceano sul termistore. 7. Monitoraggio della temperatura e dell’esperimento NOTA: Una volta che l’acqua circola attraverso il condensatore, la sonda di temperatura del termistore inizierà a visualizzare il calo di temperatura all’interno dell’oceano. L’obiettivo è che la temperatura raggiunga quasi 0 °C. Vedere la Tabella 2 per le impostazioni precise del gradiente di temperatura (termico). Salvare tutti i dati di temperatura facendo clic con il pulsante destro del mouse sull’area di stampa e salvarli come file . CSV.NOTA: il programma registrerà fino a 5000 s di dati di temperatura e quindi ricomincerà da capo. Continua ad aggiungere ghiaccio nel secchio per mantenere temperature quasi gelide, fino a quando il camino non si è sviluppato per lo più, o almeno fino a quando la siringa è quasi vuota. Monitora anche il camino a temperatura ambiente. Scatta fotografie frequenti durante la crescita del camino per entrambi i camini. Una volta completato il camino, posizionare un piccolo righello accanto a entrambi i camini, quindi scattare e salvare le immagini.NOTA: l’intero processo dovrebbe essere eseguito per ~ 6 ore. 8. Termine dell’esperimento Arrestare la pompa della siringa, quindi interrompere la registrazione della temperatura sul termistore e salvare i dati in un foglio di calcolo. Spegnere il flusso N2/Ar e rimuovere le linee e il parafilm dai vasi di iniezione. Se necessario, campionare la soluzione oceanica o precipitare per ulteriori analisi. Per rimuovere con cura la soluzione del serbatoio senza disturbare il precipitato, utilizzare una pipetta da 25 ml per pipettare con cura diverse aliquote della soluzione del serbatoio e scartare la soluzione in un becher di scarto. Scolare con attenzione il flaconcino all’interno del condensatore in un becher di scarto. Rimuovere il tubo dalla siringa e lasciare che la soluzione oceanica scarichi nel becher nella cappa aspirante. Fare lo stesso per il flaconcino senza condensatore. Rimuovere i recipienti, uno alla volta, dal morsetto e utilizzare ddH2O per risciacquare i pezzi di precipitato in un becher di scarto. Rimuovere il tubo e le siringhe dalla pompa della siringa. Svuotare le siringhe e l’eventuale liquido di iniezione supplementare nel becher di trasferimento dei rifiuti e smaltire le siringhe in un contenitore per i taglienti al solfuro conservato nella cappa aspirante. Rimuovere il tubo dal flaconcino dell’esperimento e smaltirlo in un sacchetto per rifiuti solidi. Scriminare il sigillo e smaltire il setto, il sigillo e la punta della pipetta. Risciacquare la fiala dell’esperimento di vetro e immergerla durante la notte in un bagno acido HCl da 1 M.NOTA: gli oggetti in vetro che sono stati a contatto con solfuro di sodio rilasciano gas H2S tossico quando vengono inseriti in acido. Quindi, mantenere tutti i bagni acidi all’interno della cappa aspirante.

Representative Results

Come negli studi precedenti1,2,13,29; una volta che il simulante fluido idrotermale ha raggiunto la fiala dell’oceano, è iniziata a formarsi una struttura di precipitato minerale che è diventata sempre più spessa per tutta la durata dell’iniezione. I camini di solfuro di ferro erano strutture delicate che non erano molto robuste e si disaggregavano facilmente se la fiala o l’iniezione dell’oceano erano fisicamente disturbate. Ciò è coerente con i risultati di studi precedenti3. Anche la concentrazione chimica della soluzione di solfuro ha svolto un ruolo vitale nella morfologia dei camini di solfuro. Soluzioni più concentrate di solfuro consentivano precipitati minerali più alti e robusti, come mostrato nella Figura 5,mentre concentrazioni più basse di soluzioni di solfuro producevano deboli strutture del camino. In alcuni casi, non si è formata alcuna struttura, è stata creata solo una “zuppa” minerale di solfuro liquido, che alla fine si sarebbe depositata come sedimento (Figura 3D). Ciò si è verificato sia in condizioni di gradiente termico che non termico. Negli esperimenti del camino a gradiente termico con solfuro di ferro, le strutture solide del camino generalmente non si sono coalizzate così bene come hanno fatto a temperatura ambiente. La figura 3E-H mostra la morfologia di un camino di solfuro di ferro cresciuto tra un oceano freddo e un fluido idrotermale a temperatura ambiente. I camini nel gradiente di temperatura erano di natura simile a una stringa e tenue, mentre i risultati del gradiente non termico(Figura 3A-D)mostrano strutture più semi-permanenti. Lo stesso valeva quando il fluido idrotermale veniva riscaldato (Figura 4). L’eccezione era a concentrazioni più elevate di solfuro e ferro (Figura 5) dove si formava un camino di solfuro di ferro solido tra una soluzione idrotermale a temperatura ambiente e un simulante oceanico freddo. È stato anche testato l’effetto di un gradiente termico sulla crescita dei camini di idrossido di ferro. I risultati hanno mostrato modelli simili a quelli del camino al solfuro di ferro: mentre l’esperimento dell’idrossido di ferro a temperatura ambiente ha portato a un precipitato del camino più robusto, l’esperimento del gradiente termico tra il fluido idrotermale caldo e l’oceano freddo ha portato a un tumulo più piccolo di materiale del camino che non si fondeva verticalmente (Figura 6). In contrasto con le alte strutture verticali dei camini di idrossido di ferro osservate in lavori precedenti (in esperimenti a temperatura ambiente)29, il nostro esperimento di gradiente termico ha mostrato una morfologia diversa. Figura 1: Apparecchi per camini a gradiente termico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  Figura 2: Condensatore stampato in 3D. (A) Schema di un condensatore stampato in 3D che mostra le dimensioni del condensatore. (B) Posizionamento di una nave oceanica di vetro all’interno del condensatore per raffreddare il simulante oceanico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Una varietà di camini a gradiente termico e non termico. (A-D) Esperimento di controllo del gradiente non termico dal fluido idrotermale a temperatura ambiente (HTF) al simulante oceanico a temperatura ambiente. (A) 10 mM Na2S•9H2O HTF e 20mM FeCl2·4H2O simulante oceanico. (B) 20 mM Na2S•9H2O HTF e 10 mM FeCl2·4H2O simulante oceanico. (C) 20 mM Na2S•9H2O HTF e 20mM FeCl2·4H2O simulante oceanico. (D) 20 mM Na2S•9H2O HTF e 20mM FeCl2·4H2O simulante oceanico. (E-H) Esperimento del camino a gradiente termico dal simulante HTF a temperatura ambiente a un serbatoio oceanico freddo (~ 5-10 °C). (E) 20 mM Na2S•9H2O HTF e 10 mM FeCl2·4H2O simulante oceanico. (F) 10 mM Na2S•9H2O HTF e 20 mM FeCl2·4H2O simulante oceanico. (G) 20 mM Na2S•9H2O HTF e 10 mM FeCl2·4H2O simulante oceanico. (H) 10 mM Na2S•9H2O HTF e 20 mM FeCl2·4H2O simulante oceanico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Esperimento di gradiente termico. Esperimento eseguito con soluzione calda (~35-40 °C) 20 mM Na2S•9H 2O iniettata in un freddo (~5-10 °C) 20 mM FeCl2·4H2O simulante oceanico, producendo piccoli fili di camino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Effetto della concentrazione di simulante oceanico sui camini. Concentrazioni più elevate (~50 mM Na2S•9H2O, 10 mM FeCl2·4H2O e 200 mM NaCl) di simulanti oceanici anossici hanno prodotto camini più alti e strutturalmente più alti. La soluzione di solfuro a temperatura ambiente è stata iniettata in simulante oceanico a 2-10 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Crescita simultanea di camini a gradiente termico e non termico. (A) 100 mM FeCl2·4H 2O + 100 mM FeCl3·6H 2 Osoluzioneoceanica con un simulante fluido idrotermale NaOH (HTF) da 200 mM a temperatura ambiente. (B) Esperimento di gradiente termico con le stesse concentrazioni con HTF caldo a ~ 35-50 ° C in simulante oceanico freddo a ~ 5-10 ° C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Chimica dei fluidi idrotermali (iniezione) Chimica degli oceani (Serbatoio) 50 mM Na2S 10 mM FeCl2·4H2O + 200 mM NaCl o NaHCO3 20 mM Na2S 10 mM FeCl2·4H2O + 200 mM NaCl o NaHCO3 10 mM Na2S 20 mM FeCl2·4H2O + 200 mM NaCl o NaHCO3 200 mM NaOH 100 mM FeCl2·4H2O + 100 mM FeCl3·6H2O Tabella 1: Matrice di concentrazione per lesoluzioni simulate diiniezione di fluido oceanico e idrotermale. HTF °C Temperature del simulante oceanico °C ~23 ~23 5-10 ~35-50 ~23 5-10 Tabella 2: Matrice sperimentale del gradiente termico. La temperatura del fluido idrotermale (HTF) si riferisce alla temperatura del fluido nella siringa; la temperatura effettiva all’ingresso del flaconcino oceanico era compresa tra 20 e 35 gradi inferiore alla temperatura all’interno della siringa (~70 °C) (vedere Appendice supplementare 1, Figura 3e Figura 4). File stampabile supplementare. Fare clic qui per scaricare questo file.  Appendice supplementare 1. Fare clic qui per scaricare questo file.  Appendice supplementare 2. Fare clic qui per scaricare questo file.  Appendice supplementare 3. Fare clic qui per scaricare questo file. 

Discussion

Effetto dei gradienti termici sulla crescita simulata del camino: Questo apparato sperimentale ha prodotto diverse variazioni nelle morfologie del camino che erano dovute a diversi parametri sperimentali. Camini di solfuro di ferro e idrossido di ferro formavano alte strutture verticali a temperatura ambiente, ma formavano precipitati più tenui e filanti o tumuli piatti negli esperimenti di gradiente termico. Ciò era coerente con i risultati di Herschy et al. dove precipitati di camino non eretti sono stati formati da un fluido idrotermale riscaldato a 70-80 ° C e iniettati nel simulante oceanico a temperatura ambiente33. Ci sono varie possibili spiegazioni per questo: il trasferimento di calore convettivo può causare forze di galleggiamento più naturali (insieme al pompaggio forzato dell’iniezione) per far fluire rapidamente il precipitato verso la cima della nave oceanica mentre si sta formando. In alternativa, il riscaldamento del liquido della siringa rende il simulante idrotermale meno denso e quindi più incline a salire verticalmente piuttosto che stabilizzarsi sopra il punto di iniezione. È possibile che questo effetto possa essere mitigato modificando la velocità di iniezione della siringa a velocità più lente per consentire la crescita di una struttura più stabile. White et al. hanno esaminato la crescita del camino di solfuro di ferro con il simulante idrotermale iniettato a velocità estremamente lente (0,08 ml / h) e, sebbene il camino abbia impiegato giorni per fondersi, era strutturalmente stabile13. Poiché Herschy et al. hanno utilizzato pompe peristaltiche a velocità di iniezione di 10-120 ml / h, che è di diversi ordini di grandezza più veloce delle velocità utilizzate nei nostri esperimenti sul gradiente termico, non sorprende che abbiano anche prodotto strutture di camini simili a stringhe33.

Concentrazioni più elevate di reagenti precipitanti nell’oceano e soluzioni di sfiato possono anche produrre camini più robusti nei gradienti termici. Concentrazioni chimiche più elevate di ioni precipitanti (solfuro o idrossido) nel fluido idrotermale o nel simulante oceanico possono portare a una maggiore massa precipitosa complessiva, creando così una struttura più forte. Poiché Herschy et al. e White et al. hanno utilizzato concentrazioni più basse di solfuro nel liquido idrotermale (10 mM), le loro strutture erano più piccole di quelle prodotte in questo lavoro utilizzando concentrazioni di solfuro più elevate (20-50 mM). Inoltre, alcuni studi sulla crescita del camino di solfuro di ferro hanno anche incluso la silice nel fluido idrotermale insieme al solfuro di sodio, che può aiutare a produrre camini più robusti3,13,33. Le strutture chimiche del giardino di silice sono state utilizzate anche per simulare aspetti della crescita del camino idrotermale34e queste tendono a produrre strutture molto robuste che possono essere rimosse dal tubo / fiala per l’analisi fisica. Tuttavia, gli effetti dei gradienti di temperatura sulle strutture di iniezione di silice non sono noti e saranno un’area di ulteriore studio.

Considerazioni per futuri esperimenti di simulazione del camino:Il condensatore stampato in 3D creato in questo studio per raffreddare la nave oceanica ha agito come una nave di reazione incamiciata, ma con alcuni miglioramenti pratici: 1) la parte superiore aperta ha permesso il campionamento del camino e il mantenimento dello spazio di testa anossico dell’oceano; 2) la parte stampata in 3D conferiva facile riproducibilità; 3) poiché i disegni possono essere modificati digitalmente, l’apparecchio può essere rapidamente modificato e ristampato se lo si desidera; e 4) l’uso di materiali poco costosi ha reso ogni condensatore più conveniente rispetto agli attuali recipienti di reazione rivestiti in vetro. Questi condensatori stampati in 3D sono un apparato sperimentale flessibile e facilmente condivisi che potrebbe essere un modo utile per standardizzare le piattaforme per esperimenti simulati di camini idrotermali tra diversi gruppi di ricerca, consentendo un migliore confronto di campioni e dati. I file del condensatore possono essere inviati ai colleghi per stampare da soli per i loro scopi educativi o scientifici (vedi File di stampa 3D supplementare del condensatore utilizzato in questo lavoro). Questa configurazione economica potrebbe anche essere utilizzata come esperimento di laboratorio universitario per giardini chimici o chemobrionica29,35.

In conclusione, questo lavoro descrive un nuovo apparato sperimentale che utilizza la stampa 3D per facilitare la crescita di camini idrotermali simulati in ambienti con gradiente di temperatura. Il condensatore stampato in 3D è in grado di raffreddare il simulante dell’oceano a temperature vicine allo zero, simile all’acqua di mare vicino ai sistemi idrotermali del fondo marino. Nel frattempo, una siringa riscaldata è stata utilizzata per simulare il fluido idrotermale ad alta temperatura che si inietta in questo oceano freddo. Le morfologie e le strutture dei camini di solfuro di ferro e idrossido di ferro erano influenzate dal gradiente termico: quando sia l’oceano che i simulanti di fluidi idrotermali erano a temperatura ambiente, i camini formavano strutture orientate verticalmente, ma quando il fluido idrotermale veniva riscaldato e l’oceano veniva raffreddato, la formazione di robuste strutture del camino era inibita. Per simulare accuratamente le reazioni prebiotiche in tali sistemi di camini con gradienti termici analoghi a quelli dei sistemi naturali, sarà necessario controllare attentamente parametri come la velocità di iniezione e la composizione chimica dei simulanti di sfiato e oceanici. Il condensatore stampato in 3D personalizzato ed economico creato per questo studio è simile in funzione a un vaso di reazione incamiciato e può essere facilmente modificato e distribuito elettronicamente a vari gruppi di ricerca ed educativi per l’uso in molti tipi di esperimenti chemobrionici.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata condotta presso il Jet Propulsion Laboratory, California Institute of Technology, nell’ambito di un contratto con la NASA, supportato dal NASA Astrobiology Institute Icy Worlds. Il Dr. Gabriel LeBlanc è stato supportato in parte da un Research Initiation Grant (2017-34) attraverso l’Oklahoma NASA EPSCoR Cooperative Agreement (NNX15AK42A). Vorremmo ringraziare Heather Whitehead per l’assistenza con la progettazione iniziale del condensatore stampato in 3D, Kalind Carpenter per l’assistenza con la stampa 3D, John-Paul Jones per l’utile discussione sui recipienti del condensatore, Laura Rodriguez per l’aiuto con l’analisi dei dati di temperatura ed Erika Flores con l’assistenza di laboratorio. Copyright 2020 California Institute of Technology.

Materials

3/8-Inch Clear Vinyl Tubing Watts SVIG10  Cut to desired length for experiment
40-pin Male to Female Wire Jumper Multicolored Ribbon Cables EDGELEC ED-DP_L30_Mix_120pcs These wires will require stripping of plastic ends and carefully removing one of the 2 plastic casings
Aluminum seals Fisher 0337523C Thermo Scientific National Headspace 20 mm Crimp Seals
Ferric chloride hexahydrate Fisher I88-100  Ferric Chloride Hexahydrate (Lumps/Certified ACS)
Ferrous chloride tetrahydrate Fisher I90500 Ferrous Chloride Tetrahydrate (Crystalline/Certified)
Gear Hose Clamps Glarks 40Pcs
Gray butyl stoppers Fisher 0337522AA Thermo Scientific National 20 mm Septa for Headspace Vials
Pipette tips VWR 53511-682 pipette tips 0.5-10 microliters
Serum bottles Sigma-Aldrich 33110-U Vials, crimp top, serum bottle, size 100 mL, clear glass, outer diameter x height 51.7 mm x 94.5 mm. For these experiments, the bottom of the serum bottle should be cut off.
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 reagent grade, ≥98%, pellets (anhydrous)
Sodium sulfide nonahydrate Fisher S425212 Sodium Sulfide Nonahydrate (Crystalline/Certified ACS).  Store at -20 °C. Only open in a glove box or fume hood. Releases toxic H2S gas; all sulfide-containing solutions must be kept in a glove box or fume hood.
syringe heater  Syringepump.com HEATER-KIT-5SP  Clamp gear hose clamps around heating blanket
Syringe needles (16 gauge) Fisher 14-826-18B BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 16 G x 1.5 in. (38 mm)
Syringe Pump Syringepump.com NE-4000 Dual or multiple channel, depending on desired number of simultaneous experiments
Syringes (10 mL) Fisher 14-823-16E BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle)
Tubing Cole Parmer EW-06407-71 Tygon Lab Tubing, Non-DEHP, 1/16" internal diameter X 1/8" outer diameter
Water Circulation Pump  Bayite  BYT-7A015  May need two people to help prime pump
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Sojo, V., Herschy, B., Whicher, A., Camprubi, E., Lane, N. The origin of life in alkaline hydrothermal vents. Astrobiology. 16 (2), 181-197 (2016).
  2. Barge, L. M., et al. From chemical gardens to fuel cells: Generation of electrical potential and current across self-assembling iron mineral membranes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (28), 8184-8187 (2015).
  3. Mielke, R. E., et al. Iron-sulfide-bearing chimneys as potential catalytic energy traps at life’s emergence. Astrobiology. 11 (10), 933-950 (2011).
  4. Russell, M. J., et al. The drive to life on wet and icy worlds. Astrobiology. 14 (4), 308-343 (2014).
  5. Russell, M. J., Hall, A. J. The emergence of life from iron monosulphide bubbles at a submarine hydrothermal redox and pH front. Journal of the Geological Society, London. 154 (3), 377-402 (1997).
  6. Russell, M. J., Hall, A. J., Kesler, S. E., Ohmoto, H. The onset and early evolution of life. Evolution of Early Earth’s Atmosphere, Hydrosphere, and Biosphere-Constraints from Ore Deposits, Geological Society of America. 198, 1-32 (2006).
  7. Hsu, H. W., et al. Ongoing hydrothermal activities within Enceladus. Nature. 519, 207-210 (2015).
  8. Vance, S., et al. Hydrothermal systems in small ocean planets. Astrobiology. 7 (6), 987-1005 (2007).
  9. Cardoso, S. S. S., Cartwright, J. H. E., Sainz-Díaz, C. I. Carbonate-hydroxide chemical-garden tubes in the soda ocean of Enceladus: abiotic membranes and microtubular forms of calcium carbonate. Icarus. 319, 337-348 (2019).
  10. Russell, M. J., Murray, A. E., Hand, K. P. The possible emergence of life and differentiation of a shallow on irradiated icy worlds: the example of Europa. Astrobiology. 17, 1265-1273 (2017).
  11. Yamaguchi, A., et al. Electrochemical CO2 reduction by Ni-containing iron sulfides: How is CO2 electrochemically reduced at bisulfide-bearing deep-sea hydrothermal precipitates. Electrochimica Acta. 141, 311-318 (2014).
  12. Roldan, A., et al. Bio-inspired CO2 conversion by iron sulfide catalysts under sustainable conditions. Chemical Communications. 51 (35), 7501-7504 (2015).
  13. White, L. M., Bhartia, R., Stucky, G. D., Kanik, I., Russell, M. J. Mackinawite and greigite in ancient alkaline hydrothermal chimneys: identifying potential key catalysts for emergent life. Earth and Planetary Science Letters. 430, 105-114 (2015).
  14. Barge, L. M., Flores, E., Baum, M. M., VanderVelde, D. G., Russell, M. J. Redox and pH gradients drive amino acid synthesis in iron oxyhydroxide mineral systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (11), 4828-4833 (2019).
  15. Macleod, G., McKeown, C., Hall, A. J., Russell, M. J. Hydrothermal and oceanic pH conditions of possible relevance to the origin of life. Origins of Life and Evolution of the Biosphere. 24 (1), 19-41 (1994).
  16. McGlynn, S. E., Kanik, I., Russell, M. J. Peptide and RNA contributions to iron–sulphur chemical gardens as life’s first inorganic compartments, catalysts, capacitors and condensers. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 370 (1969), 3007-3022 (2012).
  17. Cutler, K. B., et al. Rapid sea-level fall and deep-ocean temperature change since the last interglacial period. Earth and Planetary Science Letters. 206 (3-4), 253-271 (2003).
  18. Kelley, D. S., et al. An off-axis hydrothermal vent field near the Mid-Atlantic Ridge at 30 N. Nature. 412 (6843), 145-149 (2001).
  19. Kelley, D. S., et al. A serpentinite-hosted ecosystem: the Lost City hydrothermal field. Science. 307 (5714), 1428-1434 (2005).
  20. Price, R., et al. Alkaline vents and steep Na+ gradients from ridge-flank basalts-Implications for the origin and evolution of life. Geology. 45 (12), 1135-1138 (2017).
  21. Proskurowski, G., et al. Abiogenic hydrocarbon production at Lost City hydrothermal field. Science. 319 (5863), 604-607 (2008).
  22. Francheteau, J., et al. Massive deep-sea sulphide ore deposits discovered on the East Pacific Rise. Nature. 277 (5697), 523-528 (1979).
  23. Spiess, F. N., et al. East Pacific Rise: hot springs and geophysical experiments. Science. 207 (4438), 1421-1433 (1980).
  24. Hekinian, R., Fevrier, M., Bischoff, J. L., Picot, P., Shanks, W. C. Sulfide deposits from the East Pacific Rise near 21 N. Science. 207 (4438), 1433-1444 (1980).
  25. Haymon, R. M. Growth history of hydrothermal black smoker chimneys. Nature. 301 (5902), 695-698 (1983).
  26. Ishii, T., Kawaichi, S., Nakagawa, H., Hashimoto, K., Nakamura, R. From chemolithoautotrophs to electrolithoautotrophs: CO2 fixation by Fe (II)-oxidizing bacteria coupled with direct uptake of electrons from solid electron sources. Frontiers in Microbiology. 6, 994 (2015).
  27. Barge, L. M., et al. Pyrophosphate synthesis in iron mineral films and membranes simulating prebiotic submarine hydrothermal precipitates. Geochimica et Cosmochimica Acta. 128, 1-2 (2014).
  28. Barge, L. M., White, L. M. Experimentally testing hydrothermal vent origin of life on Enceladus and other icy/ocean worlds. Astrobiology. 17 (9), 820-833 (2017).
  29. Barge, L. M., et al. Chemical gardens as flow-through reactors simulating natural hydrothermal systems. Journal of Visualized Experiments. 105, e53015 (2015).
  30. Morse, J. W., Mackenzie, F. T. Hadean ocean carbonate geochemistry. Aquatic Geochemistry. 4 (3-4), 301-319 (1998).
  31. Russell, M. J., Arndt, N. T. Geodynamic and metabolic cycles in the Hadean. Biogeosciences. 2 (1), 97-111 (2005).
  32. Price, R. E., Giovannelli, D. A Review of the geochemistry and microbiology of marine shallow-water hydrothermal vents. Reference Module in Earth Systems and Environmental Science. , (2017).
  33. Herschy, B., et al. An origin-of-life reactor to simulate alkaline hydrothermal vents. Journal of Molecular Evolution. 79 (5-6), 213-227 (2014).
  34. Barge, L. M., et al. Characterization of iron-phosphate-silicate chemical garden structures. Langmuir. 28 (8), 3714-3721 (2012).
  35. Barge, L. M., et al. From chemical gardens to chemobrionics. Chemical Reviews. 115 (16), 8652-8703 (2015).

Tags

3D PrintingThermal GradientHydrothermal ChimneysExperimental MethodsTemperature ControlData CollectionEuropaEnceladusThermistorRS-232 AdapterData LoggingExperimental SetupTemperature Monitoring

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Hermis, N., LeBlanc, G., Barge, L. M. Simulation of Early Earth Hydrothermal Chimneys in a Thermal Gradient Environment. J. Vis. Exp. (168), e61789, doi:10.3791/61789 (2021).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image